1、硕士研究生论文答辩,抗猪-干扰素单克隆抗体的制备及定量抗原捕获ELISA检测方法的初步建立,报告内容,研究背景研究思路与策略试验方法及结果讨论小结与展望研究成果,研究背景,-干扰素（IFN-）是机体内具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的重要细胞因子。它主要由激活的T细胞、激活的NK细胞和巨噬细胞产生。 猪IFN-全基因编码166个氨基酸残基，包括20aa的信号肽(Dijkmans,1990)。信号肽切除后，产生146aa的IFN-单体，分子量为17.3kD，天然活性状态的IFN-是由两个IFN-单体经非共价交联形成的同源二聚体糖蛋白(Boehm,1997)。,-干扰素概述,IFN-的细胞分泌机制
2、,MHC II+抗原递呈细胞将抗原肽递呈给CD4+T细胞,使幼稚CD4+T细胞转化为具有IFN-分泌功能和增殖能力的效应Th细胞。 MHC I+抗原递呈细胞将抗原肽递呈给CD8+T细胞，使后者转化为具有IFN-分泌功能和增殖能力、靶细胞杀伤功能的效应CTL细胞。 NK细胞和巨噬细胞被病原体所携带的LPS激活后，亦能分泌IFN-。,T 细胞,IFN-检测的免疫学意义,机体的细胞免疫状态监测药物的疗效评估细胞免疫功能分析病原体T细胞表位鉴定,IFN-的免疫学检测方法,抗原捕获ELISA酶联免疫斑点试验免疫聚合酶链式反应细胞内细胞因子流式细胞术实时荧光定量RT-PCR,ELISPOT 原理,Y Y
3、Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y,Y抗IFN-单抗,卵黄抗体的免疫学特性,对细菌及哺乳动物蛋白抗原具有很高的亲和力 不与细菌或哺乳动物Fc受体结合，因而不能激活补体系统 不与哺乳动物血清中的类风湿因子反应，与哺乳动物IgG和IgM没有交差反应 疏水性比IgG强，因而更容易包被于ELISA板和乳胶微球表面 稳定性好,生物素-亲和素系统,生物素-亲和素系统是70年代末期发展起来的一种新型生物放大系统，其具有以下几个显著特点： 高灵敏度：由于每个亲和素分子可结合4个生物素分子，其结合常数高达1015mol/L，远远大于抗原抗体的结合常数（105-11mol/L），因而该系统具有放大作用，能
4、显著提高检测的灵敏度。 高特异性：亲和素和生物素的结合反应很强，并具有高度专一性。加上系统的高灵敏性，因而使试剂经得起高倍稀释，从而大大减少了通常免疫反应中出现的非特异性作用。 高稳定性 ：亲和素与生物素一旦结合就很难解离，酸、碱、有机试剂、蛋白酶等均不影响二者的结合作用。,本试验研究目的和意义,本研究旨在应用生物素-亲和素放大系统，以单克隆抗体和卵黄抗体为基础, 建立一套检测猪IFN-的定量抗原捕获ELISA方法，为进一步建立猪IFN-的ELISPOT检测方法奠定基础。,研究思路与策略,研究报告,将在大肠埃希氏菌中表达的重组猪-干扰素（rpIFN-）免疫8周龄BALB/c鼠3次后，取脾细胞与
5、SP2/0骨髓瘤细胞按标准程序融合后，用表达的重组猪-干扰素和猪-干扰素标准品进行交叉筛选，获得1株能稳定分泌抗猪IFN-单克隆抗体的杂交瘤细胞株 。利用Western-blot分析和间接免疫荧光分析对该株单克隆抗体进行特异性鉴定。,抗猪-干扰素单克隆抗体的制备,单抗的Western-blot鉴定,1.预染蛋白质分子质量标准(Fermentas) ; 2.重组猪IFN- 3.猪IFN- 标准品（R 4. BSA,本单克隆抗体能够被猪IFN- 标准品所识别,单抗的间接免疫荧光（IFA）分析,A：PMA刺激PBMC；B：未刺激PBMC,本单克隆抗体能够被天然IFN- 所识别,分离猪PBMC,PMA
6、诱导,单抗孵育,荧光二抗,卵黄抗体效价测定,高滴度抗体出现时间早，持续时间长,抗原特异性IgY的纯化,SDS-PAGE,薄层扫描分析,1. 预染蛋白分子量标准2. (NH4)2SO4粗提IgY3. 免疫亲和纯化的IgY,卵黄分离,氯仿脱脂,硫酸氨粗提,亲和纯化,抗原特异性IgY的产率为0.26mg/mL卵黄液,生物素标记的卵黄抗体的制备,生物素标记的卵黄抗体的洗脱曲线,抗体透析,生物素标记,抗体脱盐,HABA分析,平均每个IgY分子标记4.37个生物素分子,生物素标记卵黄抗体的效价,注：a.抗体起始浓度为500ng/ml；b.阴性对照为相同浓度的非标记卵黄抗体； c.OD490nm4.0,生物
7、素标记的卵黄抗体具有良好的生物活性和较高的抗体滴度,抗猪IFN-单克隆抗体的纯化,薄层扫描分析,1.蛋白Marker；2. 小鼠腹水；3. 免疫亲和纯化的单克隆抗体,SDS-PAGE,亲和层析法纯化的单克隆抗体纯度为95.1%,与A/G蛋白层析纯化的抗体纯度相当,单克隆抗体包被浓度的选择,通过单抗抗包被浓度-被检物浓度方阵试验，确定单克隆抗体的最佳包被浓度 为8ug/mL,生物素标记卵黄抗体工作浓度的选择,固定包被抗体的浓度(8ug/mL ),通过生物素标记卵黄抗体浓度- 被检物浓度方阵试验，确定生物素标记卵黄抗体的最佳稀释倍数为2000,即工作浓度 为0.25ug/mL,封闭剂的选择,采用捕
8、获抗体及检测抗体的最佳工作浓度，比较不同封闭剂的封闭效果，采用1%Casein-PBS作封闭剂，其背景最低，信噪比最高。,rpIFN-检测标准曲线,以本实验优化好的ELISA反应条件，绘制OD450值-rpIFN-抗原浓度标准曲线。,被检抗原浓度在7.8-1000ng/mL范围内能形成一条近似线性曲线。,灵敏度的确定,用稀释液作为空白对照，共设24个重复。则检测灵敏度为（OD450平均值+2SD）在标准曲线上所对应的rpIFN-浓度 。,24个空白对照的OD450平均值为0.058，标准偏差为0.0041，则 （OD450平均值+2SD）值为0.066，其对应标准曲线上rpIFN-的浓度为7.
9、8ng/mL,特异性试验（一）,目前只对商品化人IFN- 样品进行了特异性试验。应用本系统检测106IU/mL的该样品的OD450平均值为0.086，而阴性对照的平均值为0.059，因而可判定为无交叉反应。,特异性试验（二）,应用本试实验所建立的检测系统和商品化的检测小鼠IFN-的ELISPOT试剂盒检测经系列稀释的ConA样品。,ConA对基于辣根过氧化酶的ELISA检测系统具有交叉反应,临床检测,应用本ELISA方法对四头接种rPRV-HA猪连续四周的免疫血清进行-干扰素检测。,在接种重组病毒后一周，血清中-干扰素水平迅速升高，随后总体呈下降趋势,讨 论,本实验以带有融合标签和信号肽的rp
10、IFN-为抗原，以rpIFN-和不含任何庸余序列的猪IFN-标准品交叉对单克隆抗体进行筛选和鉴定，既节省了昂贵的标准抗原，又减少了单克隆抗体筛选过程中不必要的时间浪费本实验采用免疫亲和层析的方法从小鼠腹水中纯化单克隆抗体，从而保证了所得抗体的特异性用鸡作宿主,高滴度抗体出现时间早，持续时间长，因而可实现抗体的大规模生产 ConA能结合含-D-呋喃甘露糖和-D-呋喃葡萄糖糖基的糖蛋白或多糖，而抗体分子，辣根过氧化酶（HRP）富含甘露糖残基，这可能就是本实验建立的ELISA方法对ConA产生交叉反应的直接原因,结 论,成功制备了一株抗猪-干扰素的单抗，该单抗能够被商品化猪IFN-和体外诱导的IFN
11、-所识别利用免疫亲和层析纯化得到猪-干扰素特异性的卵黄抗体，平均每个抗体分子可标记4.37个生物素分子以亲和纯化的抗猪-干扰素单抗作为捕获抗体，生物素标记的卵黄抗体作为检测抗体，初步建立了猪-干扰素定量抗原捕获ELISA检测方法，其最小检出浓度可达7.8ng/mL ConA对基于辣根过氧化酶的ELISA检测系统具有交叉反应,致 谢,本实验是在哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室生物二室完成的。感谢导师童光志研究员和陈焕春教授三年来对我辛勤的培育和无私的帮助！,发 表 论 文,1. 余斌，张强，闫丽萍，陈焕春，童光志.抗猪-干扰素单克隆抗体的制备和鉴定.中国预防兽医学报 （已接收）2. 猪-干扰素定量抗原捕获ELISA检测方法的建立（拟发表）,敬请各位答辩委员、老师、同学批评、斧正！,感谢各位老师和同学参加我的毕业论文答辩！,
