1、 1 从雄烯二酮发酵废液中分离甾醇和 油脂的 工艺研究 1 王 莹 1,2 刘凤霞 1,2,* 薛 刚 1,2 娄源民 3 何际芳 1,2 （南阳理工学院生物与化学工程学院 1，南阳 473004） （ 河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室 2，南阳 473004） （ 河南恒天久大实业有限公司 3，郑州 450001） 摘 要 :以雄烯二酮发酵废液为原料， 采用有机溶剂萃取法和重结晶的方法对原料进行处理，分离获得甾醇和雄烯二酮产品。通过单因素实验考察不同溶剂、不同配比、不同温度等因素对分离影响。研究结果 显示：以乙酸乙酯为溶剂，按料 液比（ 1:3）萃取温度 50 、萃取两次、结晶温度为
2、 0 、结晶时间为 6 h、结晶二次得到甾醇提取率为 46%，纯度达到 80%以上；按料液比 1:3 加入甲醇溶解浓缩物，浓缩到体积的一半后，冷却结晶 18h， 经离心得到雄烯二酮粗品。上清液再次浓缩，回收溶剂和副产品大豆油。 该研究结果实现了 雄烯二酮 发酵废液的变废为宝及资源化综合利用。 关键词 :发酵废液，萃取，甾醇，雄烯二酮，重结晶 中图分类号 :Q815 文献标识码 :A doi: Study on isolation of sterols and lipid from the androstenedione fermentation waste liquid Wang Ying1,
3、2, Liu Fengxia1, 2, *, Xue Gang1,2, Lou Yuanmin3, He Jifang 1,2 (1. School of Biological and Chemical Engineering, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473004, China; 2. Henan Key Laboratory of Industrial Microbial Resources and Fermentation Technology, Nanyang 473004, China; 3. Henan Kingdo Ind
4、ustries Co. Ltd., Zhengzhou 450001, China) Abstract: In this paper androstenedione fermentation waste liquid was employed as a raw material. Organic solvent extraction and recrystallization were carrieded out on this research. Sterols and androstenedione products has been gained. Single factor exper
5、iment was used to invest the effect of different solvents, different proportions and different temperature on the separation . The results showed: ethyl acetate as the solvent, according to the solid-liquid ratio (1: 3) extraction temperature 50 , extraction twice, the crystallization temperature is
6、 0 , crystallization time 6 h, crystallized twice to obtain sterol extraction rate of 46% purity more than 80%; by solid-liquid ratio of 1: 3 methanol was added to dissolve the concentrate, concentrated to half volume followed by cooling crystallization 18 h, centrifuged and the precipitate obtained
7、 androstenedione crude products. The solvent was obtained again with by-product soybean oil by concentrating the supernatant. The results of this study have 基金项目： 河南省科技攻关计划项目 (172102310470)； 收稿日期： 2018-04-08 作者 简介 ： 王莹 ，女， 1984年出生， 硕士，工业微生物菌种的选育及应用 ， 生物活性成分的分离、提取 通讯作者： 刘凤霞 ， 女 ， 1960年出生， 硕士 ，工业微生物菌种
8、的选育及应用，生物活性成分的分离、提取 2 realized the comprehensive utilization of the waste liquor of androstenedione fermentation. Key words: waste fermentation, extraction, sterols, androstenedione, recrystallization 雄烯二酮在甾体激素类药物中是不可或缺的重要中间体，现代工业 主要 采用双液相体系甾体微生物转换 法 生产雄烯二酮 1, 2。微生物转化甾醇的培养系统需要 添加 20%的植物油和 0.4%的甾醇，经微
9、生物转化、甲醇提取、脱色、浓缩、结晶、重结晶得合格的雄烯二酮 3-6。 回收甲醇后的乳化液中含有 70%-80%油脂和没被转化的甾醇， 且含有较高浓度油脂和微生物菌体、蛋白质、多糖等物质，最终结合产生高度稳定的乳化液废弃物，其 处理问题成为目前制约企业发展的一个难点 7-11。 本 研究 为 企业 委托开发项目 ， 研究探索一套合理的回收油 脂和甾醇工艺，使回收的油脂经过初步精炼后能够循环使用，或者将回收油脂能够作为生物柴油的原料，并将回收的甾醇作为雄烯二酮生产的原料，实现雄烯二酮发酵废液的变废为宝及资源化综合利用， 为以后此领域的研究开发奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 实验所
10、用 乙酸乙酯、石油醚、甲醇、三氯甲烷、正丁醇等试剂均为分析纯，购自 天津市科密欧化学试剂有限公司；雄烯二酮发酵废液由 河南恒天久大实业有限公司提供。 1.2 仪器 与设备 7890B气相色谱仪 ； GL-20G-C高速冷冻离心机； RE-52A旋转蒸发器。 1.3甾醇与雄烯 二酮的检测 样品处理 :取发酵液中上层样品 1 2 mL，用同样体积的乙酸乙酯充分溶解，静置分层，取上层清液稀释 100 倍后进样检测。 气相色谱检测条件 :色谱柱 mxt5，柱温 210 ，保持 3 min，以 30 /min 的速度升温到 290 保持 10 min，进样口温度 300 ， FID 300 ，载气分流比
11、是 20:1，氮气流速 1 mL/min， 空气流速 500 mL/min，进样量 5 L。 1.4 分离甾醇和 油脂 的工艺步骤 将雄烯二酮发酵废液进行预热处理，按一定比例加入萃取溶剂，经过在一定的温度条件下，进行 萃取，经离心后，去沉淀，上清液放入一定温度条件的冰箱里，冷却结晶后，离心，沉淀物即为甾醇粗品，上清液 进行减压蒸馏 浓缩，回收溶剂，并得到副产品大豆油，在大豆油中加入溶解雄烯二酮效果较好的有机溶剂，同样进行萃取，离心后冷冻结晶，待结晶养成后， 经 离心得到雄烯二酮粗品 。 上清液再次浓缩，回收溶剂和副产品大豆油 。 分离甾醇和雄烯二酮工艺示意图 如图 1 所示 ： 3 发 酵 废
12、 液萃 取上 相下 相 弃 之离 心上 清 液沉 淀 弃 之结 晶过 滤 沉 淀 物 为 甾 醇滤 液浓 缩回 收 溶 剂浓 缩 物溶 剂萃 取上 相下 相浓 缩 到 一 半 结 晶过 滤沉 淀 物 为 雄 烯 二 酮 粗 品滤 液浓 缩回 收 溶 剂得 大 豆 油大 豆 油溶 剂图 1 分离甾醇和油脂工艺示意图 1.5 有机溶剂萃取法提取甾醇的工艺参数优化 1.5.1 有机溶剂的 选择 称取雄烯二酮发酵废液 5 g，分别按体积比为 1:3 在试管加入有机溶剂甲醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、乙醇、丙酮、正丁醇各 15 mL，并标记名称，置于 50 恒温水浴锅中 2 h 后，观察其分相情况以及
13、现象，以萃取液上相高度为基准，确定最佳的有机溶剂。 1.5.2 料液比的选择 称取五份雄烯二酮发酵废液 5 g，按 1:1、 1:1.5、 1:2、 1:2.5、 1:3 的不同料液比加入最佳有机溶剂，置于恒温水浴 50 条件下 2 h 后，观察其分相情况，以萃取液上相溶液的高度为基准，确定最佳的料液比。平行实验， 重复 3 次 。 1.5.3 萃取温度的选择 称取四份雄烯二酮发酵废液 5 g， 选择 确定的最佳料液比加入有机溶剂，分别在室温（ 19 ）、 30、 40、50 条件下 2 h 后，观察其分相情况与现象，以萃取液上相溶液的高度为基准，确定最佳的萃取温度。平4 行实验， 重复 3
14、次 。 1.5.4 萃取时间的选择 称取三份雄烯二酮发酵废液 5 g， 选择 确定的最佳萃取温度加入有机溶剂，分别在 30、 60、 90、 120 min的不同时间条件下，观察其分相情况与溶液的透明度，以萃取液上相溶液的高度为基准，确定最佳的萃取时间。平行实验， 重复 3 次 。 1.5.5萃 取次数的选择 分别称三份取雄烯二酮发酵废液 5 g，分别萃取一次、两次、三次，在恒温水浴 50 下 2 h，吸取上相溶液，在 -10 条件下，离心 10 min，转速 4000 r/min，取上清液到试管中，放入 0 的冰箱中结晶 6 h，然后过滤，称量沉淀物的湿重。平行实验， 重复 3 次 。 1.
15、5.6不同浓度有机溶剂对分离甾醇工艺的影响 分别称取四份雄烯二酮发酵废液 5 g，按 优选的 最佳条件，分别加浓度为 100%、 96%、 93%、 90%的有机溶剂进行萃取，在恒温水浴 50 下萃取 2 h，吸取上相溶液在 -10 离心 10 min，转速 4000 r/min，并记录上相溶液体积。经离心后，取上清液倒入试管中，在 0 下结晶 6 h，再次离心，称量沉淀物湿重。平行实验， 重复 3 次 。 1.6 冷却结晶法分离甾醇的工艺参数优化 1.6.1结晶温度的选择 分别称取三份雄烯二酮发酵废液 5 g，按 实验确定 的最佳萃取次数，在恒温水浴 50 下 2 h 后，经萃取后，取上相于
16、 -10 离心 10 min，转速 4000 r/min，取上清液倒入小试管中，并编号，在 10、 0 和 -10 条件下冷却结晶 6 h，观察其结晶情况与现象。然后过滤，称量沉淀物的湿重。平 行实验， 重复 3 次 。 1.6.2 结晶次数的选择 分别称取三份雄烯二酮发酵废液 5 g，在实验确定 的最佳条件下，进行试验后，取萃取上相溶液于 -10 离心 10 min，转速 4000 r/min，取上清液倒入小试管中，并编号，放在 确定的 最佳条件下，结晶 6 h 后，经过滤，沉淀物称量其湿重，而滤液再次倒入试管，放入冰箱继续结晶 6 h，然后过滤，并再次称量其湿重，取滤液再次结晶 6 h。再
17、次过滤，称量沉淀物湿重。观察三次结晶的情况与现象。平行实验， 重复 3次 。 1.7 溶剂回收及雄烯二酮的分离 将分离甾醇后的上清液进行减压蒸 馏回收溶剂。并得到一定浓度的浓缩物，然后向浓缩物中添加溶剂甲醇进行萃取，浓缩甲醇相到一半，冷冻结晶，冷冻离心沉淀物即雄烯二酮及其他副产品。再将上清液进行浓缩回收有机溶剂以及其他副产品。 2 结果 和分析 5 2.1有机溶剂萃取法提取甾醇的工艺参数优化 2.1.1 有机溶剂的选择比较 称取质量 5 g 的雄烯二酮发酵废液， 按料液比 1:3 分别加入丙酮、甲醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂 15 mL，充分摇匀，在恒温水浴 50 下萃取 2
18、 h 后，观察溶剂的萃取 情况。 结果 显示：甲醇、乙醇、丙酮虽然能够快速分出沉淀，但 得到的甾醇和油较少。石油醚 和 三氯甲烷则无法高效地实现破乳效果，影响后续工艺操作；只有乙酸乙酯作为萃取剂时，不会形成乳化液，因此破乳剂优选为乙酸乙酯。 乙酸乙酯与乙醇最好，其余溶剂的效果不佳 。 乙酸乙酯作为中等极性溶剂，在萃取油水两相中不会形成乳化液， 且较容易过滤。 而其他非极性溶剂在分离时会形成乳化液，对甾醇的分离造成很大的影响， 使得 分离甾醇较难。因此，本实验初步选择的最佳溶剂为乙酸乙酯。 2.1.2 料液比对分离工艺的影响 称取五份雄烯二酮发酵废液 5 g， 按 1:1、 1:1.5、 1:2
19、、 1:2.5、 1:3 的不同料液 比加入溶剂乙酸乙酯，置于恒温水浴 50 条件下 2 h 后，观察其分相情况以及萃取液的颜色透明度变化，以萃取液上相溶液的高度为基准， 有机溶剂不同料液比的沉降高度比较见 表 1。 图 2 有机溶剂不同料液比 、不同萃取时间及温度 的 乙酸乙酯相 沉降高度比较 为判断不同料液比对分离甾醇工艺的影响是否显著，以确定最佳的料液比，对上述单因素进行方差分析， 不同料液比对萃取量的影响方差分析见 表 1。 表 1 不同料液比 及萃取次数 对萃取量的影响方差分析 变异来源 料液比 萃取次数 df SS S2 F F（ 4.10） df SS S2 F F（ 2.6）
20、处理间 4 69.904 17.476 5243* F0.05=3.48 2 1.136 2.725 160.294* F0。 05=5.14 处理内 10 0.033 0.003 F0.01=5.99 6 0.100 0 017 F0.01=10.92 6 总变异 14 69.937 8 1.236 注 ： *表示显著水平， *表示极显著水平。 结果 显示： 料液比对萃取分离甾醇的结果达到极显著水平，为了确定不同料液比与分离效果的影响差异，采用 LSD(最少 显著数法 )进行显著性比较。 不同料液比对乙酸乙酯高度的显著性比较见 表 2。 表 2 不同料液比 及萃取次数 对乙酸乙酯高度的显著性
21、比较 料液比 平均数 差异显著性 萃取次数 平均数 差异显著性 =0.05 =0.01 =0.05 =0.01 1:3 9.167 a A 二次 1.267 a A 1:2.5 7.567 b B 三次 0.778 b B 1:2 6.733 c C 一次 0.633 c C 1:1.5 4.033 d D 1:1 3.433 e E 由结果分析 ： 在料液比在 1:1 到 1:3 之间，乙酸乙酯的萃取率在随料液比的增加不断增大，五组不同料液比均达到极显著水平。因此选取料液比为 1:3 最佳。 2.1.3 萃取温度对分离工艺的影响 称取四份雄烯二酮发酵废液 5 g，按料液比为 1:3 加入 1
22、5 mL的乙酸乙酯溶剂，分别在室温（ 19 ）、30、 40 和 50 条件下 2 h 后，观察其分相情况与现象，以萃取液上相溶液的高度为基准， 不同萃取温度的分析比较见 图 1。 为判断不同萃取温度对分离甾醇工艺的影响是否显著，以确定最佳的温度，对上述单因素进行方差分析， 不同萃取温 度对分离工艺的影响方差分析见 表 3。 表 3 不同萃取温度 、 萃取时间 及乙酸乙酯浓度 对分离工艺的影响方差分析 变异来源 df 萃取温度 萃取时间 乙酸乙酯浓度 F（ 3.8） SS S2 F SS S2 F SS S2 F 处理间 3 9.743 3.248 177.152* 3.249 1.083 2
23、.725 0.750 0.250 4.918* F0.05=4.07 处理内 8 0.147 0.018 3.180 0.398 0.407 0.051 F0.01=5.99 总变异 11 9.890 6.429 注 ： *表示显著水平， *表示极显著水平。 结果显示，萃取温度对萃取分离甾醇的结果达到极显著水平，为了确定不同温度与分离效果的影响差异，采用 LSD(最少显著数法 )进行显著比较。 不同萃取温度对萃取量的显著性比较见 表 4。 表 4 不同萃取温度 、 萃取次数 、乙酸乙酯浓度 对萃取量的显著性比较 萃取温度/ 平均数 差异显著性 萃取时间 /min 平均数 差异显著性 乙酸乙酯浓
24、度 平均数 差异显著性 =0.05 =0.01 =0.05 =0.01 =0.05 =0.01 50 9.133 a A 120 6.733 a 120 100 6.733 a A 40 8.667 b B 90 6.667 a 90 96 6.667 a A 30 8.067 c C 60 6.400 a 60 93 6.400 a A 19 6.733 d D 30 5.433 b 30 90 5.433 b B 结果显示在温度 19 到 50 之间，乙酸乙酯的萃取率随温度的增加而增大，四组数据均达到极显著7 水平。因此，选取 萃取温度为 50 为最佳。 2.1.4 萃取时间对分离工艺的影
25、响 称取三份雄烯二酮发酵废液 5 g，按 1:3 的料液比加入乙酸乙酯，分别在 30、 60、 90 和 120 min 的不同时间条件下，观察其分相情况与溶液的透明度，以萃取液上相溶液的高度为基准。 不同萃取时间的分析比较见 图 1。 为判断不同萃取时间对分离甾醇工艺的影响是否显著，以确定最佳的萃取时间，对上述单因素进行方差分析， 不同萃取时间对分离工艺的影响方差分析见 表 3。 结果显示，不同萃取时间对萃取分离甾醇的结果未达到极显著水平，为了确定不同萃取时间与分离效果的影响差 异，采用 LSD(最少显著数法 )进行显著性比较。 不同萃取时间对工艺影响的显著性比较见 表 4。 结果表明萃取时
26、间在 30120 min 范围内， 30 min与 120 min 有显著性差异， 60 min 与 90 min 差异不显著，考虑对分离提取率的效果，选择萃取时间为 120 min 为佳。 2.1.5 萃取次数对分离工艺的影响 称取雄烯二酮发酵废液 5 g，按料液比 1:3 加入乙酸乙酯 15 mL，分别按一次、二次、三次进行萃取，在恒温水浴 50 放置 2 h 后，上相离心后置于 0 条件下结晶 6 h，离心称量沉淀物湿重， 不同萃取次数的 比较见 表 5。 表 5 不同萃取次数的比较 萃取次数 结晶物湿重 /g 1 2 3 一次 0.6 0.6 0.7 二次 1.2 1.3 1.3 三次
27、 0.2 0.6 0.5 为判断不同萃取次数对分离甾醇工艺的影响是否显著，以确定最佳的萃取次数，对上述单因素进行方差分析， 不同萃取次数对分离工艺的影响方差分析见 表 1。 结果显示，不同萃取次数对萃取分离甾醇的结果达到极显著水平，为了确定不同萃取次数与分离效果的影响差异，采用 LSD(最少显著数法 )进行显著性比较。 不同萃取次数对工艺影响的显著性比较见 表 2。 结果分析 ： 在萃取次数分别为一次、二次、三次萃取范围内，对甾醇的分离均达到极显著差异，根据分离的效果比较，选择萃取次数为两次最佳。 2.1.6 不同浓度 乙酸乙酯对分离效果的 影响 比较 分别称取四份雄烯二酮发酵废液 5 g，按
28、料液比 1:3 分别加浓度为 100%、 96%、 93%、 90%的有机溶剂进行萃取，在恒温水浴 50 下萃取 2 h，吸取上相溶液在 -10 离心 10 min，转速 4000 r/min，并记录上相溶液体积。经离心后，取上清液倒入试管中，在 0 下结晶 6 h，再次离心，称量沉淀物湿重， 乙酸乙酯8 的 浓度 对分离效 果的比较见 表 6。 表 6 乙酸乙酯的 浓度 对分离效果的比较 乙酸乙酯 浓度 /% 萃取液体积 /mL 结晶物湿重 /g 1 2 3 1 2 3 100 13 12 11 0.8 1.5 2.2 96 15.5 11.1 12.2 0.7 0.9 1.1 93 13
29、8.5 11 1.0 0.8 0.6 90 12.5 9.5 11 0.7 0.5 0.3 为判断不同乙酸乙酯浓度对分离甾醇工艺的影响是否显著，以确定最佳的乙酸乙酯浓度，对上述单因素进行方差分析， 不同纯度乙酸乙酯对工艺的方差分析见 表 3。 结果显示，不同乙酸乙酯浓度对萃取分离甾醇的结果达到显著水平，为了确定不同乙酸乙酯浓度对分离效果的影响差异，采用 LSD(最少显著数法 )进行显著性比较。 不同 浓度 乙酸乙酯对工艺影响的显著性比较见 表 4。 结果分析 ： 在乙酸乙酯不同浓度的范围中，纯度为 100%、 90%达到显著性差异， 96%、 93%未达到显著性差异，根据乙酸乙酯分离甾醇效果的
30、比较，考虑溶剂的循环有效利用，选择乙酸乙酯浓度为 90%为最佳条件。 2.2冷却结晶法分离甾醇的工艺参数优化 2.2.1 不同结晶温度对工艺影响 的单因素试验 分别称取三份雄烯二酮发 酵废液 5 g，萃取两次，在恒温水浴 50 下 2 h 后，经萃取后，取上相于 -10 离心 10 min，转速 4000 r/min，取上清液倒入小试管中，并编号，在 10 、 0 、 -10 条件下冷却结晶 6 h，观察其结晶情况与现象。然后过滤，称量沉淀物的湿重。 不同结晶温度的分析比较见 表 7。 表 7 不同结晶温度的分析比较 结晶温度 / 结晶物湿重 /g 1 2 3 10 0.6 0.7 1.0 0
31、 1.6 1.3 2.3 -10 0.8 0.6 0.5 为判断不同结晶温度对分离甾醇工艺的影响是否显著， 以确定最佳的结晶温度，对上述单因素进行方差分析， 不同结晶温度的对分离工艺影响的方差分析见 表 8。 表 8 不同结晶温度的对分离工艺影响的方差分析 变异来源 df SS S2 F F（ 2.6） 处理间 2 2.162 1081 9.828* F0。 05=5.14 处理内 6 0.660 0.110 F0.01=10.92 总变异 8 2.822 注 ： *表示显著水平， *表示极显著水平。 结果显示，不同结晶温度对萃取分离甾醇的结果达到显著水平，为了确定不同结晶温度与分离效果的9
32、影响差异，采用 LSD(最少显著数法 )进行显著性比较。 不同结晶温度对工艺影响的显著性比较见 表 9。 表 9 不同结晶温度对工艺影响的显著性比较 结晶温度 （ ） 平均数 差异显著性 =0.05 =0.01 0 1.733 a A 10 0.766 b A -10 0.633 b B 结果分析 :在 0 、 10 、 -10 之间，只有 0 与 -10 达到显著性差异， 10 未能达到显著性差异，根据对分离甾醇提取率的影响，选择 0 为最佳结晶温度。 2.2.2 不同结晶次数 及结晶温度 对工艺影响 的两因素试验 分别称取三份雄 烯二酮发酵废液 5 g，按 1:3 的料液比加入乙酸乙酯，在
33、恒温 50 水浴中萃取 2 h，并萃取两次，取萃取上相溶液于 -10 离心 10 min，转速 4000 r/min，取上清液倒入小试管中，并编号，在 0 条件下，结晶 6 h 后，经过滤，沉淀物称量其湿重，而滤液再次倒入试管，放入冰箱结晶 6 h，然后过滤，并再次称量其湿重，取滤液再次结晶 6 h。再次过滤，称量沉淀物湿重。 不同结晶次数 及结晶温度 的分析比较见 表 10。 表 10 不同结晶次数 及结晶温度 的分析比较 结晶温度 / 结晶次数 1 2 3 10 2 0.5 0.2 0 2.3 0.6 0.5 -10 1.3 0.5 0.1 为判断不同结晶次对分离甾醇工艺的影响是否显著，以
34、确定最佳的结晶次数，对上述单因素进行方差分析， 不同结晶次数对分离工艺影响的方差分析见 表 11。 表 11 不同结晶次数 及结晶温度 对分离工艺影响的方差分析 变异来源 df SS S2 F F（ 2.4） 处理间 4 4.784 1.196 19.573* F0。 05=6.94 A 2 4.409 2.204 36.073* F0.01=18.0 B 2 0.376 0.188 3.073* 处理间 4 0.344 0.061 总变异 8 5.029 注 ： *表示显著水平， *表示极显著水平。 结果显示，不同结晶次数对萃取分离甾醇的结果均达到极显著水平，为了确定不同结晶温度和结晶次数对
35、分离效果的影响差异，采用 LSD(最少显著数法 )进行显著性比较。 不同结晶次数对工艺影响的显著性比较见 表 12。 表 12 不同结晶次数对工艺影响的显著性比较 结晶次数 平均数 差异显著性 10 =0.05 =0.01 一次 1.867 a A 二次 0.533 b B 三次 0.267 b B 结果表明在不同的结晶次数下，一次、二次均达到显著性差异，三次未能达到显著性差异，根据结晶次数对分离甾醇提取率的影响，选择最佳结晶次数为二次。 2.3 验证试验 按照上述工艺进行验证试验，以乙酸乙酯为溶剂，按料液比（ 1:3）萃取温度 50 、萃取两次、结晶温度为 0 、结晶时间为 6 h、结晶二次
36、得到甾醇提取率为 46%，纯度达到 80%以上；按料液比 1:3 加入甲醇溶解浓缩物，浓缩到体积的一半后，冷却结晶 18h，离心，沉淀物得到 含 雄烯二酮 粗品的 产品，提取率为 66.61%。 上清液再次浓缩，回收溶剂和副 产品大豆油。 3 讨论 3.1 有机溶剂异丙醇、正己烷、石油醚对甾醇和雄烯二酮均有良好的溶解性，但在一定温度条件下分相效果上不佳，原因是发酵液中会形成乳化剂，使得分相难。实验选择采用中等极性的乙酸乙酯溶剂，在不需加任何助滤剂的情况下就可以自然沉降，从而解决工业上需要离心需消耗大量试剂的问题。 3.2 甾醇和雄烯二酮 在大豆油中均具有良好的溶解，在发酵液中加入 20%的大豆
37、油时，甾醇的转化率达到到 85%以上，在经过乙酸乙酯萃取后，分离甾醇后，可以浓缩回收溶剂以及大豆油，使得大豆都可以同时重复使用，与其他研究学者所研究 的两相系统比较 2，工艺更加简便，在工业上更具有可行性，而且分离效果也较好。 3.3 通过单因素实验考察乙酸乙酯的倍数、萃取温度、萃取时间、萃取次数对分离甾醇的 影响，确定最佳工艺条件为 ： 萃取料液比 1:3， 萃取温度 50 ， 萃取次数为二次 ， 萃取时间为 2 h。与 文献报道 酶法甲酯化提取甾醇相比较 12， 该工艺 操作更加简单可行。 参考文献 1 林彦良 . 甾体化合物微生物转化的研究 D. 济南 : 山东大学 , 2009, 18
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