利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象.DOC

1、北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 化学学院 2000 级 葛宁 目录 第一章 绪论 .1 一、 背景知识 .1 二、 关于 MjsHSP16.5 1 第二章 试验内容及方法 .4 一、 MjHSP16.5 的表达 .4 二、 MjHSP16.5 的分离与纯化 .6 三、 MjHSP16.5 浓度的测定 .9 四、丙稀酰胺对 Trp 的荧光淬灭 .10 第三章 结果讨论 .1 4 致谢 15 参考文献 16 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 1 第一章 绪

2、论 一 、 背景知识 热休克蛋白 Heat Shock Proteins (HSPs),是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应急蛋白质。 当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为五类，分别为HSP100， HSP90， HSP70， HSP60 以及小分子热休克蛋白 small Heat Shock Proteins (sHSPs)( Kyeong et al., 1998)。 小分子热休克蛋白分子量为 12-34KD，它的分布极为广泛，从细菌到人的基因组里都有小分子热休克蛋白的基因。 与其他大分 子

3、的热休克蛋白不同的是，小分子热休克蛋白似乎对于细胞的功能并不是必不可少的。但是， sHSPs 具有多种功能，包括赋予细胞以耐热性以抵抗高温，作为分子伴侣以防止蛋白聚集，对坑正常的细胞死亡，从而调节细胞的生存和死亡的平衡。能避免底物变性的 sHSPs 最少量与底物和热休克蛋白都有关 (Rosalind et al., 1998)。 许多小分子热休克蛋白基因一般并不表达，显著表达小分子热休克蛋白一般是细胞受到外部刺激的时候，比如高温刺激。现已发现，除了热刺激之外还有许多物理、化学刺激可以激活小分子热休克蛋白的表达，例如 紫外线、射线、机械损伤、酸、氧化剂等等。可见，小分子热休克蛋白是抵御外界不良刺

4、激的重要物质。 二、关于 MjsHSP16.5 1蛋白的结构 来自 Methanococcus jannaschii（ 一种甲烷球菌属古细菌 ） 的热休克蛋白 MjHSP16.5，相对分子量 16500kD，共 167 个氨基酸残基， 是第一个有晶体结构数据的小热休克蛋白。它的序列中存在一段长 90 个残基的 -晶状体结构域（残基 46 至 135），此结构域与人的 A-晶状体蛋白有 20.7%的相似性，与水稻的 HSP16.9 有 31.4%的相似性 (Rosalind et al., 1998)。 图 1. MjHSP16.5 的单体结构 MjHSP16.5 的结构已经解出。它是一个中空的

5、球状的 24 聚体，分子量约 16500kD。聚合体的外径约 120，内径约 65。球的内部是空的，并没有明显的电荷密度。 它具有非常规则的结构，对称性包括 12 个二重轴， 3 个三重轴， 3 个四重轴， 8 个三重轴窗口， 6北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 2 个四重轴窗口，边长分别为 30 和 17 。 聚合体中的每一个折叠单位是由组成两个 片的结构、两个短的 310-螺旋和一个短的结构组成的，其中一个结构来自相邻的折叠单 位。蛋白 N-末端的32 个氨基酸残基高度无序的。从第 33 个残基开始，是蛋白的 -晶状体结构域 ，在蛋白的 C

6、-末端还有一段长 12 个残基的短小结构 (Dana A. Haley et al., 2000)。每个蛋白的折叠单位大小为 25 28 75，最长的方向与折叠片的长轴平行。 MjHSP16.5 的 24聚体中的每一个单位都与其他单位有很强的联系。对应于复合体中二重、三重、四重对称轴，一共存在三种折叠单位间的相互作用。最强的相互作用存在于二重轴周围：一个单位的 2-折叠和另一单位的 6-折叠通过形成氢键已 形成单位间的折叠片，同时强烈的疏水相互作用和静电力也使该结构得到北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 3 稳定。在四重轴周围，由于氢键、静电力和

7、疏水相互作用，四个分子互相接触。而在三重轴周围，单位间的作用力最弱，只有离子间作用力是三个单位组成的三角形顶角处稳定( Kyeong et al., 1998)。 2 jHSP16.5 对细胞和蛋白的热保护 实验表明，在表达了 MjHSP16.5 的大肠杆菌提取物中， 75%的蛋白在 80 高温下因为被保护而没有聚集沉淀，而提纯得到的 MjHSP16.5 对大肠杆菌提取物有相同的作用，说明对大肠杆菌的热保护主要是由 MjHSP16.5 完成的。另外，对于变性温度为 80 的单链应乐果甜蛋白（ single chain monellin）， MjHSP16.5 一样可以阻止其在变性温度下发生聚集

8、 (Rosalind et al., 1998)。 一种可能机制是， 可能在体内，在这个过程中，蛋白或对细胞重要的 RNA 可以嵌入MjHSP16.524 聚球状体的空腔或表面。另一种可能性是， MjHSP16.5 多聚体与他的功能和活性无关，而是一种蛋白的储存状态：当蛋白受到外界压力的时候，多聚体就会迅速分解。 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 4 第二章 实验内容及方法 一、 MjHSP16.5 的表达 1. 原理 蛋白质表达是为获得大量的目标蛋白质而进行的有目的性的蛋白质合成。常用方法是将编码所需产物的基因插入质粒或其他载体，然后将该载体

9、导入活细胞，进行大量合成。 大多数克隆载体都以大肠杆菌作为宿主。因为大肠杆菌具有两个特征：操作简易和能在廉价的培养基上迅速的生长。 在大肠杆菌里表达外源基因一般是始于将基因插入表达载体（一般是质粒）。载体应具有的几种元件有： 选择标志的编码序列，它可供筛选以确定载体是否进入了细胞； 可控转录 启动子，经诱导后从克隆化基因产生大量的 mRNA； 转录调控序列，如一个合适的核糖体结合位点和起始密码子 ATG； 一个多限制酶位点接头，便于外源基因以正确方向插入载体中。 含有待表达基因的载体构建好后，经转化导入大肠杆菌某一合适菌株中。 编码 MjHSP 16.5 的基因（ Mj285）已经从古细菌 M

10、athanococcus jannaschii 中得到克隆，利用 PCR 技术扩增，并插入带有氨苄（ AMP.）抗性的载体 pET21a 质粒（ Novagen出品） 中。将此载体转化进入宿主 E.coli BL21(DE3)，宿主体内含有质粒 pSJS1240，此质粒含有可以编码 E.coli 的 tRNA 稀有密码子（精氨酸密码子 AGA 和异亮氨酸密码子ATA），并带有壮观霉素 (Spectinomycin)抗性。我们用含 Amp. 和 Spec. 的 LB 培养基来筛选出可以表达 MjHSP 16.5 的菌株。得到的菌株在适当条件下大量培养，即得到表达出所需蛋白的细胞。 2 仪器和试剂

11、 仪器 a) YXQG02 型蒸汽消毒器：山东新华医疗仪器厂； b) LS-B50L 立 式 圆 形 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 ： 张 家 港 市 华 菱 医 疗 设 备 制造有限公司； c) CS501-SP 超级数显恒温器：重庆四达实验仪器厂； d) Model 4518 台式恒温培养摇床： Forma Scientific Inc.； e) Spectrumlab PC 22 分光光度计：上海棱光技术有限公司； . f) Sorvall RC 5C Plus 冷冻离心机： Kendro Laboratory Products； 其他常规仪器：电子分析天平；漩涡混合器；一次性培养皿；烧杯

12、；锥形瓶；接种环；酒精灯；微 量移液器；离心管（ 500ml， 50ml）；一次性小离心管（ 1.5ml， 0.6ml）；滴管；玻璃棒。 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 5 试剂 a) LB 液体培养基： 每 100ml Tryptone： 1g Yeast-extract： 0.5g NaCl： 1g 加水至 100ml并用 NaOH 调 pH 至 7 b) LB 固体培养基： 每 100ml液体培养基中加入 1.5g 琼脂 (Agar-B) c) Ampicillin(Amp.) 50mg/ml 每 10ml Ampicillin： 50

13、0mg ddH2O： 10ml d) Spectinomycin(Spec.) 50mg/ml 每 10ml Spectinomycin： 500mg ddH2O： 10ml e) 1M IPTG 每 5ml IPTG： 1.2g ddH2O： 4.5ml f) 0.8% NaCl 溶液 每 100ml NaCl ： 0.8g ddH2O： 100ml 注：配制 Ampicillin 和 Spectinomycin 时要无菌操作。在无菌环境中将配好的溶液过一次性滤器装入无菌细口瓶，于 4 冰箱中保存。 3 实验步骤 3.1 转化质粒 pET21a： a) 配制 LB 液体培养基两份各 50ml

14、， LB 固体培养基一份 50ml。 0.1MPa 下灭菌 20min。 b) 待培养基冷却而固体培养基未凝固时加入 50mg/ml Amp. 和 Spec. 各 50 l，摇匀，倒平板。向一瓶液体培养基中加入 Amp. 和 Spec. 各 50 l；另一瓶液体培养基中加入 Spec. 50 l。 c) 在含 Spec. 的液体培养基中加入 10 l E.coli BL21(DE3)，恒温摇床上 37 ，150rpm培养 6 小时，至 O.D.至 0.6 左右。 d) 取 1ml菌液，离心，弃上清液。 e) 加入 100 l 0.1M CaCl2 重悬菌体沉淀，加入 3 l pET21a 质粒

15、，振荡均匀。冰浴北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 6 30 分钟左右，保持细菌处于感受态。 f) 于 42 恒温水浴下热休克 45 秒 （时间要精确） 。 g) 冰浴 1 2 分钟。 h) 取 50 l 菌种于含 Amp. 和 Spec. 的固体培养基中，涂布均匀。在恒温摇床上于37 ， 150rpm下培养 16 小时左右。出现分布均匀的单菌落证明转化成功。 3.2 菌种保藏 a) 单菌落接入含 Amp. 和 Spec. 的培养基内，恒温摇床上 37 ， 150rpm下培养 8小时左右，至 O.D.值为 1。 b) 取 1ml菌液于 1.5ml

16、小离心管中，加入 80无菌甘油至终浓度 8%-10%，于 20冰箱中保存。 3.3 大量培养： 取菌种 200 l于 1L 已灭菌的 LB 培养液 (含 50 g/ml Amp., 30 g/ml Spec.)中，37 ， 150rpm 下摇床培养 8 小时左右，至 菌体 O.D.（ 600nm）值为 0.8-1。 3.4 诱导： 加入 IPTG 500 l（终浓度为 0.5M），继续在 37oC， 150rpm下培养 2 小时左右。诱导过程中，菌不再生长。 注：以上所有操作均在无菌条件下进行。 3.5 收获菌体： 将菌液于 4 ， 5000g 下离心 10min；弃去上清液，用 0.8% N

17、aCl 溶液重悬菌体，再于 4 ， 5000g 下离心 10min；沉淀的菌体于 20 下保存。 二、 MjHSP 16.5 的分离与纯化： 1. 原理： 为了提高蛋白纯度，我们借鉴文献的纯化方法（ Kyeong Kyu Kim et al.,1998），摸索出了一套纯化方法。使用分离纯化生物大分子最高效液相色谱分离技术，连续使用三种色谱法：离子交换色谱，疏水作用色谱，凝胶过滤色谱。 1.1 离子交换色谱 氨基酸是一种兼性离子，在生理条件下，羧基带负电，氨基带正电。由于不同的氨基酸侧链不同，使其具有不同的酸碱性，从而在生理条件下又带上了额外的电荷。自然，有大量氨基酸组合而成的蛋白质，也有可能是

18、带电体。 离子交换色谱，是利用被分离物质带电性质不同而达 到分离效果的一类液相色谱。色谱柱的固定相上带有可解离的阳（阴）离子，当带有同种电荷的物质流入柱内，会将该种离子置换出来，从而停留在柱内。逐渐加大洗脱液的离子强度，或者改变体系北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 7 的 pH 值，都可能使新的离子取代被提纯物质的位置，从而是物质被洗脱下来。电荷性质不同的物质，与固定相间的作用力不同，洗脱时间不同，从而达到分离提纯的效果。 1.2 疏水层析 疏水层析是基于溶质，极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式。它利用分离的物质的疏水性

19、质不同，而达到分离效果的。与疏水作用相对的是静电作用力。在很高离子浓 度时，被分离物质因为与柱内固定相间的疏水相互作用而被停留在柱内。根据相似相容原理，降低洗脱液的离子强度，增加了流动相与被分离物质间的疏水作用，加大了物质离开固定相的趋势，直至被洗脱下来。 1.3 凝胶过滤色谱 凝胶过滤色谱是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液以及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质以及一些蛋白质复合物被阻挡在外。因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比小分子量蛋白更早的被洗脱下来。最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小；中 等的蛋白质

20、可以进入填料分子中较大的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。 2. 仪器和试剂 仪器 a) FPLC Fast protein, peptide, and polynucleotide liquid chromatography 快速（蛋白，多肽，核酸）液相层析仪 ： PHARMACIA； b) 阴离子交换柱 5ml High-Trap Q 柱： PHARMACIA； c) 疏水柱 Hi PREP Octyl FF d) 凝胶过滤柱为 Superose S200 e) Sorvall RC 5C Plus 冷冻离心机： Kendro Laboratory Products； f) JY92

21、-II 超声细胞粉碎机：上海新芝生物技术研究所； g) SHB-88 循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司； h) 0.22 微米一次性无菌滤器。 其他常规仪器： 电子分析天平；电磁搅拌器；烧杯；微量移液器； 50ml 离心管；一次性使用无菌注射器滴管；玻璃棒。 试剂 a) 50mM Tris-HCl pH 7.5 每 100ml Tris： 1.212g ddH2O： 95ml 用 HCl 调至 pH7.5 后，室温保存； b) 100mM PMSF (剧毒 )： 每 15ml PMSF： 261mg 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象

22、8 异丙醇： 15ml 溶解后分装 750 l/管， 20oC 保存； c) 1M DTT （储液）： 每 100ml DTT： 1.55mg ddH2O： 10ml， 20oC 保存； d) 200mM PBS 缓冲液（ 5 倍储液） pH6.9 每 1L Na2HPO4 100mM： 358.14g； NaH2PO4 100mM： 156.01g； e) Buffer A： 40mM PBS 缓冲液 将储液 d）稀释 5 倍； 0.45 m滤膜过滤； f) Buffer B： 每 1L 储液 d）： 200ml； NaCl： 58.44g （ 1M）； ddH2O ：配至总体积为 1L；

23、0.45 m滤膜过滤； g) Buffer C： 每 1L 储液 d）： 200ml； (NH4)2SO4： 201.18（ 1.5M）； ddH2O： 配至总体积 1L； 0.22 m滤膜过滤； h) Buffer D： 每 1L 储液 d） 200ml； NaCl： 5.844g （ 0.1M）； ddH2O： 配至总体积 1L； 0.45 m滤膜过滤； i) 蔗糖；固体，分析纯； j) (NH4)2SO4：固体，分析纯； 3实验步骤 3.1 破壁（机械 法）： 北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 9 1） 配制破壁用缓冲液： 每 3g 菌

24、50mM Tris-HCl： 15ml； 100mM PMSF： 150 l； 蔗糖： 3g； 1M DTT： 60 l； 2）破壁： 将收获的菌体用破壁缓冲液重悬，冰水浴中，以 3 秒脉冲（ 3 秒开， 3 秒关）超声破壁 120 次，超声功率为 400W，至混合液呈半透明。 注：破壁后的溶液要马上进行下一步提纯，因为破壁后的溶液里含有蛋白酶会降解蛋白。 3）离心： 将破壁后的液体于 4 ， 24000g 下离心 20min，上清液 0.22 滤膜过滤。 3.2 色谱法分离 （均以 1L 培养液所得约 3g 菌体为例）： 1） 离子交换色谱： a） 将蛋白样品用 0.22 m滤膜过滤； b）

25、 以 Buffer A 为 A 泵溶液， Buffer B 为 B 泵溶液，采用 5ml Hitrap Q 柱，取蛋白溶液每次 5ml进行分离。用 A 泵上样，用 buffer A 冲平。洗脱为 30%B-60%B，在 30%B-60%B 收集。收集样品后加入 (NH4)2SO4 至 1.5M。 2） 疏水层析 疏水柱 Hi PREP Octyl FF，依次以 1M NaOH, dd 水， buffer C 充分 平衡；上一步样品 0.22 m 滤膜过滤后用 B 泵上样，在用 buffer C 冲平。洗脱为 100%C-0%C，在 60%C-25%C 收集，洗脱峰约为 47%C。收集溶液超滤浓

26、缩小于 2ml。 3） 凝胶过滤色谱 凝胶过滤柱为 Superose S200。用 2ml loop，一次上样 2ml。收集方式为峰收集，50mAu 时停止收集。一次收集 1.5ml，最后收集的样品应舍弃第一管。 3.3 保存 用 millipore Ultra free 15 超滤管浓缩， 1： 1 加入已经灭菌的 80%甘油， -20保存。 三、 MjHSP16.5 浓度的测定 1. 原理 蛋白质通常在波长 280nm 处，有最大吸收峰，因此可以利用紫外可见分光光度计，测出一定浓度蛋白溶液在该波长下的吸收。再根据蛋白浓度和吸收强度成正比的定理，利用该蛋白的吸光系数，求出溶液中蛋白的浓度。 据文献报道 MjHSP16.5 在 280nm 处的吸光系数为 0.565(mg/ml)-1cm-1，使用光程 1cm的吸收池，故可利用公式计算蛋白浓度。