1、生物色谱技术,因为有同学没有学习过色谱，我们大概介绍一下色谱技术的起源。色谱技术最初就是俄国的植物学家茨维特发明的。1906年，茨维特在研究植物色素的过程中，做了一个经典的实验：在一根玻璃管的狭小一端塞上一小团棉花，在管中填充沉淀碳酸钙，这就形成了一个吸附柱。然后将其与吸滤瓶连接，使绿色植物叶子的石油醚抽取液自柱中通过。结果植物叶子中的几种色素便在玻璃柱上展开：留在最上面的是两种叶绿素；绿色层下面接着叶黄素；随着溶剂跑到吸附层最下层的是黄色的胡萝卜素。这样吸附柱成了一个有规则的与光谱相似的色层。然后把该潮湿的吸附柱从玻璃管中推出，依色层的位置用小刀切开，于是各种色素就得以分离。再用醇为溶剂将色
2、素溶解出来，即得到了各成分的纯溶液，由此实现了色素的分离和制备。1903年，他将这一研究成果发表在华沙的生物学杂志上，这就是有关色谱法的第一篇研究论文。但当时他用俄文写的报告未能引起人们的兴趣，一直到他死后威尔施塔特重新介绍了这种方法时，他的工作才受到了人们的注意。,色谱法,3,1903 Mikhail Tswett defines the Science of Chromatography,Chromatography Inventor M. S. Tswett(茨维特),生物色谱法,生物色谱法（Biochromatography）是20世纪80年代中后期问世，由生命科学与色谱分离技术交叉形
3、成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术。,细胞膜色谱法,亲和色谱法,常规色谱法,固定相含有生物大分子,固定相和研究对象都是生物大分子,研究对象是生物大分子,4,细胞膜色谱,Cell Membrane Chromatography, CMC,将细胞膜结合到硅胶表面，制成细胞膜固定相，利用色谱学技术研究流动相中药物与受体相互作用规律的受体动力学新方法。,特点：分离 + 活性筛选 合二为一 适合于天然药物活性成分的筛选及药物作用机理的研究。,5,举例,1A肾上腺素受体高表达细胞膜色谱,a：酚妥拉明,b：5-羟色胺,c：甲氧明,d：羟甲唑啉,6,亲和色谱,Affinity Chromatography，A
4、C 利用生物大分子具有对某一类生物大分子特异性识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。,亲和识别 ： 抗体-抗原 酶-底物 激素-受体,7,IgG蛋白,8,亲和色谱分离原理,2. 配体与目标物吸附；,3. 洗脱目标物；,1. 找与底物专一可逆结合的配体, 将配体通过共价键偶联到载体。,9,4. 亲和柱再平衡。,亲和体系,10,核酸结合蛋白,11,A蛋白,12,从A型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分离而得的一种细胞壁蛋白。可与人类大多数类型的IgG(IgG3除外)的Fc段结合，但很少或几乎不与人类的IgM结合。用于免疫分析和
5、IgG的提纯。,葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA),免疫球蛋白A（immunoglobulin A， IgA）,已有研究证明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影响呼吸道粘膜对病原体的抵抗力，两者呈正相关。1. 与病毒或细菌毒素结合，从而阻止它们进入或破坏细胞；2. 附着在细菌的鞭毛上，让其活动性减弱，并且更容易被巨噬细 胞吞噬.,亲和色谱纯化抗体原理,13,亲和色谱分离示意图,14,亲和色谱的固定相,无机氧化物：SiO2、Al2O3、ZrO3生物聚合物：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖、葡聚糖等。,固定相,1. 载体 （support，又称基体mat
6、rix）,15,特异性配体,生物素亲和素、抗原抗体、酶抑制剂、激素受体,通用性配体,凝集素各种糖蛋白，核酸RNA、RNA蛋白质,2. 配位体 （ligand，又称底物 substrate）,亲和色谱的固定相,16,亲和色谱的固定相, 脂肪族有机物或多肽、蛋白组成； 具有双官能团，一端连接载体，一端偶联配体； 长度直接影响固定相的立体效应； 可在对载体进行化学改性的时候形成； 可具有疏水性或亲水性。,3. 间隔臂 （spacer或spacer arms）,小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。,17,亲和色谱的洗脱方式,18,阶梯式梯度,线性梯度,影响洗脱过程的因素,1
7、. 离子强度：提高离子强度，亲和作用减弱或完全破坏。2. pH值：在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其它pH下，亲和作用减弱或完全破坏。3. 离液剂：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用。4. 温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；疏水性相互作用增强。5. 液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱。6. 螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失,19,中压液相色谱仪,北京东西分析仪器有限公司LC-5600系列常（中）压生化制备液相色谱仪,20,GE公司,举例,21,常规色谱,亲和柱,22,反相色谱法,水 + 乙腈,23,反相色谱分离多肽,24,反相色谱分离多肽重现性,重现性好
8、！,25,反相色谱分离蛋白,26,体积排阻色谱,分子量大的先被洗脱出来，分子量小的后被洗脱出来。,原理：是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法， 体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。,27,28,体积排阻色谱,离子交换色谱,原理：利用被分离组分与固定相之间发生离子交换能力的差 异来实现分离。,29,阳离子交换树脂 大都含有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)或苯酚基(-C6H4OH)等酸性基团，其中的氢离子能与溶液中的金属离子或其他阳离子进行交换。,2R-SO3H+Ca2+-(R-SO3)2Ca+2H+,硬水软化原理,离子交换色谱,30,阴离子交换树脂 大都含有季胺基-N(CH3)3OH、胺基(-NH2)或亚胺基(-NH2)等碱性基团。它们在水中能生成OH-离子，可与各种阴离子起交换作用。,R-N(CH3) 3OH+Cl- -RN(CH3) 3Cl+OH-,离子交换色谱,蛋白质具有两性性质，在一定pH缓冲溶液中，呈现出正电荷或负电荷。,阴离子交换树脂 (Anion exchange resin),31,阴离子交换色谱,阳离子交换色谱,32,离子交换色谱,
