1、中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica1Vol. ，Issue ， 第 卷第 期年 月川贝母新资源太白贝母中水溶性成分的含量测定黄林芳 1，段宝忠 1，王丽芝 1，魏大 华 2，卢其福 2 ，陈士林* 1（1. 中 国 医 学 科 学 院 药 用 植 物 研 究 所 ，北 京 100193；2. 广 州 潘 高 寿 药 业 股 份 有 限 公 司 ，广 州 511490）【摘要】 目的： 建立 RP-HPLC-DAD 同时测定太白贝母药材中 7 种核苷类活性成分（胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷）及碱基（尿嘧啶、腺 嘌呤）含量的方法。方
2、法：采用 Zorbax SB-Aq C18 色 谱柱（4.6 250 mm，5 m），流动相为甲醇和水，梯度洗脱，流速 1 mLmin-1，检测波长 260 nm，柱温为 25。结果：尿嘧啶 、胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷、腺嘌呤的质量分别在0.312 37.440，1.095 65.700，1.020 61.200，1.075 64.500，0.812 48.720，1.070 64.200，0.432 25.920 gmL-1浓度内呈良好线性关系。平均回收率为 96.96103.52 %，RSD 3.80 %。，符合分析要求。结论：太白贝母有紫外吸收的水溶性成分主要是核苷类成分，所建立方法
3、 简单、重复性好，准确可靠，可用于 贝母药材中核苷类化合物的含量测定，为全面开发利用贝母药材提供进一步依据。【关键词】 太白贝母；水溶性成分；HPLC-DAD；质量控制1太白贝母为百合科贝母属植物太白贝母 Fritillaria taipaiensis P.Y.Li 的干燥鳞茎，为 2010 年版中华人民共和国药典 （一部）川贝母项下新收载基原植物。太白贝母商品在民间作为川贝母使用具有悠久的历史 1，并被 四川省中药材标准 、 甘肃省中药材质量标准和宁夏中药材标准等多省药品标准收载作川贝母使用。笔者在实际调查中发现其植物形态与川贝母 Fritillaria cirrhosa D. Don.区别
4、较难把握 2，且有过渡 3，肖培根、陈心启等学者也认为包括太白贝母在内的川贝母复合群是川贝母商品“青贝”的主要来源，都可以作为川贝母使用 4, 5。川贝母 F. cirrhosa 的化学成分主要是生物碱和水溶性非生物碱成分 6, 7，其水溶性成分已有研究报道 12, 13，但太白贝母水溶性成分尚无研究报道。最近的研究表明，贝母的水溶性成分具有抗炎、抑制血小板凝聚、降压、松弛平滑肌等作用 8-10，而贝母的抗炎作用能协同治疗呼吸道感染，是贝母止咳化痰的药理学基础 11，太白贝母在民间传统用法也是用水煎剂，探讨其水溶性成分，对研究太白贝母与川贝母的相似性和阐明其药效具有一定的意义。为更好的、全面的
5、开发利用贝母且为其质量控制提供进一步依据，笔者在前期对川贝母 F. cirrhosa 成分及太白贝母相关研究的基础上 6, 14，采用 HPLC-DAD 法测定了太白贝母药材中的水溶性成分，现将研究结果报道如下。1 仪器、药品与试剂1.1 Waters 2690 HPLC 系统，包括四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器，恒温柱箱，996 DAD 检测器，Empower 2 工作站。Agilent Zorbax SB-Aq C18 色谱柱（4.6 mm250 mm，5 m，USA） ，超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，KQ-400KDE） 、离心机（Sigma，1-14 ） 、电子分析天平
6、（Mettler，AB135-S ） 。收 稿 日 期 2010-06-20基金项目 科 技 部 十 一 五 支 撑 计 划 项 目 （ 2006BAI09B05-3） ； 中 央 级 公 益 性 科 研 院 所 科 研 业 务 专 项 （ NO.1381） ； 2007中 医 药 行 业 专 项 基 金（ 200707007） ； 2008中 医 药 行 业 专 项 基 金 （ 200807020）通 讯 作 者 *陈 士 林 ， 男 ， 研 究 员 ， 博 士 生 导 师 ， Tel： （ 010） 62811448， E-mail: 。 研 究 方 向 ： 中 药 资 源中 国 中 药
7、杂 志China Journal of Chinese Materia Medica2Vol. ，Issue ， 第 卷第 期年 月1.2 核苷类对照品尿嘧啶（Uracil） 、胸苷（Thymidine ） 、腺苷（Adenosine）和尿苷（Uridine）购于中国药品生物制品检定所；胞苷（Cytidine）购于天津奎青商贸有限公司；鸟苷（ Guanosine） 、腺嘌呤（Adenine）购于 Solarbio 公司，对照品纯度经 HPLC 峰面积归一化法计算大于 98%。1.3 色谱级甲醇、乙腈（Fisher Scientific，Fairlawn New Jersey） ，水为超纯水，其
8、他试剂均为分析纯。1.4 5份太白贝母样品采于重庆市，见表 1。经陈士林教授鉴定为太白贝母F. taipaiensis P.Y.Li，凭证标本存放于中国医学科学院药用植物研究所标本馆。药材经烘干后粉碎，过80目筛，备用。2 方法与结果2.1 色谱条件 Agilent Zorbax-SB-Aq C18柱（4.6 250 mm，5 m）；流动相为甲醇（A）与水（B）；流速1 mLmin -1；检测波长260 nm；柱温25 ；进样量20 L，见表1。表 1 流动相梯度洗脱程序Time / min Methanol / %Water / %0.0 1 9913.0 5 9522.0 10 9030.
9、0 20 8040.0 30 7050.0 40 602.2 系统适用性 在2.1色谱条件下检测各相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95 1.16之间；理论塔板数均大于11400（USP），对照品及太白贝母药材样品中 7 个核苷类成分基线分离，HPLC 色谱图见图 1。2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取上述核苷类对照品适量，分别加水制成每1 mL含尿嘧啶1.04 mg、胞苷1.095 mg、尿苷1.02 mg、鸟苷1.075 mg、胸苷1.015 mg、腺苷1.07 mg、腺嘌呤1.08 mg的溶液，超声溶解，即得，分别精密吸取一定量各对照品溶液，置于5 mL量瓶中，稀释至
10、刻度，混合均匀，得混合对照品储备液。2.4 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末1.0 g，置50 mL锥形瓶中，精密加水10 mL，混匀，室温下超声提取60 min（ 32 KHz），然后离心10 min（4000 rpm），取上清液用0.45 m微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。2.5 标准曲线与线性关系考察 分别精密吸取上述混合对照品储备液5，10，40，100，200，400，600，800 L至1 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得 7 个不同浓度的混标溶液。按上述色谱条件进行HPLC分析，每个浓度进样三次，以峰面积（Y）对其浓度（X）建立回归方程，见表 2。表 2 线性回归方程及相关
11、系数对照品 线性方程 r 线性范围gmL-1LOQ (gmL-1)LOD (gmL-1)尿嘧啶 Y = 22 568.013 X + 8 762.200 0.999 9 0.312 37.440 0.156 0.094 胞苷 Y = 7 329.204 X + 2 563.912 0.999 8 1.095 65.700 0.274 0.110尿苷 Y = 11 942.000 X + 6 512.336 0.999 8 1.020 61.200 0.357 0.204 鸟苷 Y = 11 710.000 X + 3 322.415 0.999 8 1.075 64.500 0.108 0.0
12、53胸苷 Y = 11 298.000 X + 3 682.798 0.999 8 0.812 48.720 0.325 0.122腺苷 Y = 19 285.032 X + 11 289.012 0.999 8 1.070 64.200 0.375 0.161腺嘌呤 Y = 31 474.000 X + 2 937.900 0.999 8 0.432 25.920 0.302 0.0652.6 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样 6次，每次20 L，计算各对中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica3Vol
13、. ，Issue ， 第 卷第 期年 月照品色谱峰面积相对标准偏差（RSD），RSD 小于2.81，表明本法精密度良好。2.7 重复性实验 取同一样品 6 份按 2.4 项下方法制备，进样测定。计算 7 个核苷类成分含量，其RSD小于 2.65 %。2.8 稳定性实验 取上述供试品溶液 分别在 0、4、8、 12、18、24 h 进行测定，计算含量，RSD 值均小于 2.94，说明各对照品溶液在 24 h 内稳定。2.9 回收率实验 取已知含量的药材细粉 6 份精密称定，分别精密加入一定量的对照品，按 2.4 项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，平均回收率在96.96%103.52%
14、 之间，RSD 3.80 %。见表3。表3 7个核苷类成分回收率（n6） 化合物 样品中含量(g g-1) 加入量(g) 测得量(g) 回收率(100%) RSD (%)尿嘧啶 9.824 9.360 18.899 96.96 0.79胞苷 24.441 21.900 45.912 98.04 3.21尿苷 162.641 153.000 321.021 103.52 2.75鸟苷 79.102 86.000 167.216 102.46 1.61胸苷 16.089 15.225 31.117 98.71 3.80腺苷 153.892 160.500 309.694 97.07 1.22腺嘌呤
15、 11.1092 10.800 22.108 101.85 1.862.10 样品分析 将样品按2.4方法制备，平行操作三次，用回归方程计算尿嘧啶、胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和腺嘌呤 7 个核苷类成分的含量，样品和对照品HPLC色谱图见图 1，结果见表 4、图 2。表 4 太白贝母中7 种核苷类成分含量测定结果g g-1(n=3)来源 尿嘧啶 胞苷 尿苷 鸟苷 胸苷 腺苷 腺嘌呤巫溪县 4.710 0.04 15.011 0.33 75.022 1.01 34.601 0.82 14.377 0.08 105.310 1.61 7.308 0.13巫溪县 4.318 0.11 42.730
16、0.85 183.031 0.37 109.778 1.02 21.812 0.37 182.886 1.29 7.088 0.09巫溪县 tr 11.421 0.26 75.502 0.09 41.688 0.17 tr 77.467 0.78 tr巫溪县 9.824 0.39 24.441 0.12 162.641 0.16 79.102 0.63 16.089 0.17 153.892 0.93 11.092 0.18城口县 4.612 0.27 14.624 1.13 74.689 0.68 34.036 0.91 14.511 0.83 105.382 0.82 7.484 0.64
17、tr：检测限以下 12213344556677ABt /minA.对照品；B.供试品溶液；1.尿嘧啶；2.胞苷；3.尿苷；4.鸟苷；5.胸苷；6.腺苷；7.腺嘌呤。图1 同时测定太白贝母7种水溶性成分的HPLC图中 国 中 药 杂 志China Journal of Chinese Materia Medica4Vol. ，Issue ， 第 卷第 期年 月050100150200Uracil Cytidine Uridine Guanosine Thymidine Adenosine AdenineContent(g/g)图2 5 批太白贝母样品中 7 种化合物含量分布柱状图3 讨论3.1
18、提取方法的考察本实验考察了超声和回流提取两种方法，二者提取效率相当，由于超声提取简便易操作，最后选择用超声提取法。由于腺嘌呤和尿嘧啶等在有机溶剂中不溶，仅在热水中微溶，因此用水作为溶剂提取，另外，还考察了提取时间和提取液用量，最终确定提取方法为10 mL H 2O超声提取60 min。3.2 分离条件的选择 核苷类物质极性大，较难分离，本实验比较了以下 5 种色谱柱，(1) Symmetry C18 column (4.6 150 mm，5 m)，(2) Zorbax Extend-C18 (4.6 250 mm，5 m)，(3) Zorbax SB-Aq C18 (2.1 150 mm，3.
19、5 m)，(4) Zorbax SB-Aq C18 (4.6 250 mm, 5 m)，(5) SunFire C18 (4.6 150 mm，5 m)。实验结果表明，Zorbax SB-Aq C18 (4.6 250 mm，5 m) 柱对 7 种核苷类成分分离良好；色谱柱 1、2、3不能很好的分离 7 种核苷类成分；而色谱柱 5 峰形较差。同时还比较了甲醇和乙腈洗脱，发现甲醇分离较乙腈分离效果好，因此最终选择了Zorbax SB-Aq C 18 (4.6 250 mm, 5 m) 柱和甲醇作为流动相洗脱。4 结论本文采用 HPLC-DAD 方法，根据样品峰最大吸收波长和保留时间鉴定了太白贝母
20、中的 7 个成分，实验结果表明，太白贝母有紫外吸收的水溶性成分主要是核苷类，从分析的 5 批样品来看，均含有尿嘧啶、胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和腺嘌呤，这与川贝母 F. cirrhosa 的水溶性成分的研究结果一致 14，从水溶性成分来看，2010 年版药典将太白贝母作为川贝母使用有一定的科学依据。在几种成分中，尿苷、鸟苷和腺苷的含量相对较高（图 2）。本方法操作简便，重复性好，准确可靠，可用于贝母类药材核苷类成分的测定。参考文献 1 陈平，霍春生. 五峰尖贝原植物形态及有效成分研究J. 武汉植物学研究，1993，11(3)：215-218.2 段宝忠，陈锡林，黄林芳，等. 太白资源学研究概
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22、中草药，2009(1)：15-17.8 黄丽晶，高文远，李霞，等. 平贝母水提物抗炎作用研究J. 天津中医药，2009，26(6)：495-496.9 Kang D G, Sohn E J, Lee Y M, et al. Effects of bulbus Fritillaria water extract on blood pressure and renal functions in the L-NAME-induced hypertensive ratsJ. Journal of ethnopharmacology, 2004, 91(1): 51-56.10 邹冈. 神经药理学M.
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24、Issue ， 第 卷第 期年 月Simultaneous Determination Seven Nucleosides and Nucleobases in Aqueous Extracts of Fritillaria taipaiensis P.Y.Li Using HPLC-DADHUANG Lin-fang1, DUAN Bao-zhong1, WANG Li-zhi1, WEI Da-hua2, LU Qi-fu2, CHEN Shi-lin*1(1.Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medi
25、cal Sciences 2.Guangzhou Pangaoshou Pharmaceutical Co., Ltd, Guangzhou, 511490, China)Abstract Objective: To develope a high performance liquid chromatography coupled with a photodiode array detector (HPLC-DAD) method for simultaneous determination of 7 nucleosides and nucleobases in Fritillaria tai
26、paiensis. Method: The analyses were performed on An Agilent Zorbax-SB-Aq -C18（4.6 250 mm，5 m）was used for all analyses. The investigated compounds were separated with gradient mobile phase consisting of water and Methanol. The flow rate was 1.0 mLmin -1; the detection wavelength was 260 nm. The temp
27、erature of sample manager was set at 25 and the injection volume was 20 L. Result: The investigated compounds including uracil, cytidine uridine guanosine, thymidine, adenosine, and adenine were shown good linearity (r 0. 999 8) over the tested ranges. The average recovery was 96.96103.52%with RSD 3
28、.80 %. Conclusion: The accuracy, stability, repeatability and average recovery of the method are satisfying, and the seven nucleosides and nucleobases components of F. taipaiensis can be rapidly and accurately quantified by HPLC-DAD. This work provided helpful information for comprehensive quality evaluation of F. taipaiensis.Key words Fritillaria taipaiensis; Aqueous Extracts; HPLC-DAD; Quality control
