1、1正交试验法优选健肾片的提取工艺郭传宝 曹光环 邵杰 尚强 徐连明 萧伟*( 江苏康缘药业股份有限公司,江苏 连云港 222001)摘要 目的: 优选健肾片的提取工艺。方法:考察黄芪的形状对黄芪甲苷提取率的影响，并采用正交实验法, 以提取液中黄芪甲苷、淫羊藿苷的得率和干膏率为考察指标，考察加水量、提取时间和提取次数三个因素对提取结果的影响。结果: 最佳提取工艺为：加 8 倍量水提取 2 次，每次 1.5h，黄芪药材炮制的形状为段长（510mm）。结论: 该工艺合理可行，含量测定方法稳定可靠。关键词 健肾片；提取工艺；正交试验；淫羊藿苷；黄芪甲苷Study on the Extraction P
2、rocess for Jianshen Pian by Orthogonal TestGuo Chuanbao,CAO Guanghuan, SHAO Jie，SHANG Qiang, XU Lianming, XIAO Wei*(Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.Ltd, Lianyungang, Jiangsu 222001,China )Abstrct Objective: To optimize the extraction technology for Jianshen Pian. Method: The shape of Radix Astragal
3、us was studied on the content of astragaloside ,and orthogonal test was used for studying the effect of water volume , extraction time and times on the content of Icariin，astragaloside and solid.Result: The optimal extraction process is as follows: with 8 times of water extracted twice, each time fo
4、r 1.5 h, and processing method of Radix Astragali is cutting for about 510mm . Conclusion: The extraction process is reasonable and feasible. The method of content determination is accurate and reliable. Key words Jianshen pian; extraction technology; orthogonal test; Icariin; astragaloside 健肾片是由黄芪、
5、淫羊藿、茯苓、僵蚕、全蝎、泽泻、石韦、 青风藤八味中药提取精制而成的中药复方制剂，具有健脾益肾，补气清利，祛风通络的功效，用于慢性肾小球肾炎，临床上诊断为脾肾气虚兼有湿邪证候的患者。黄芪和淫羊藿为方中君药，黄芪甲苷和淫羊藿苷分别为其主要活性物质，具有多方面的药理作用 1,2,且其稳定性好。根据黄芪、淫羊藿和立项单位：国家科技部，计划名称：重大新药创制，项目名称：创新中药中试放大研究技术平台，项目编号：2009ZX09313-032 2作者简介：郭传宝(1974- )，男，工程师，学士，中药制剂和创新中药的开发与研究。Tel： 051885521933； Email: 。*通讯作者：萧伟（195
6、9），男，研究员级高级工程师，博士学位，主要从事中药制剂和创新中药的开发与研究，Tel：0518-85521956。茯苓的主要化学成分的理化性质，为提高有效成分的提取效率，将上述 3 味药物进行水提取。本实验以黄芪甲苷和淫羊藿苷的提取率及干浸膏得率为指标，用正交试验法优选最佳提取工艺，为工业化生产提供依据。1 仪器与试药Agilent 1100 型高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司），Chemstation 色谱工作站；Waters 2695 高效液相色谱仪 ,Waters 2420 ELSD 蒸发光散射检测器。黄芪甲苷对照品：购于中国药品生物制品检定所（110781-200613，供
7、含量测定用) ； 淫羊藿苷对照品：购于中国药品生物制品检验所（0737200611，供含量测定用）。药材黄芪、淫羊藿、茯苓均由连云港市康缘大药房工程师吴舟鉴定，分别为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bag.var.mongholicus(Beg.)Hsiao.的干燥根、小檗科植物淫羊藿(Epimedium grandiflorum Morr.)的地上部分、为植物多孔菌科茯苓 Poria cocos(Schw.)Wolf 的菌核。乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。2 评价指标测定方法2.1 干浸膏得率的测定 分别准确称取处方量的黄
8、芪、淫羊藿、茯苓,按设定的方案进行提取,滤过,滤液合并,冷藏静置,离心除杂，精密量取每次实验所获得的离心后药液 100 mL置已干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干,再于 105干燥 3 h。置干燥器中冷却 30 min,迅速称重,进行总固量的测定，然后推算出每次实验所获得的药液的总固量，作为每次实验的干浸膏得率。2.2 黄芪甲苷含量的 HPLC 测定 3 2.2.1 色谱条件 色谱条件：色谱柱为 Agilengt C18柱(150 mm4.6 mm ,5m)，柱温：30，流动相：乙腈-水（31：69），流速：1.0mL.min -1，ELSD 漂移管温度：49，喷雾加热级别：60%，气体流速：20L
9、.min -1,进样量 20uL。色谱图见图 1。3aba-对照品 b-供试品 图 1 黄芪甲苷色谱图2.2.2 对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品 30.0 mg 置于 50 mL 容量瓶中 ,加入无水甲醇定容至 50mL,配制为 0.6 mg.mL -1 的黄芪甲苷对照品储备溶液。2.2.3 供试品溶液制备 准确量取每次实验所获得的离心后药液体积，从中精密量取100mL，于旋转蒸发仪浓缩至干,残渣加水 20mL 超声溶解后,转移至分液漏斗,以水饱和的正丁醇萃取 4 次(30mL/次）,合并正丁醇萃取液,用氨试液充分洗涤 2 次(30 mL/次) ,弃去氨液 ,正丁醇层蒸干,残渣加水
10、5mL 微热使溶解,放冷,过 D101 型大孔吸附树脂(内径 1.5cm ,长12cm),用 50 mL 水洗脱,弃去水液,再用 40%乙醇 30mL 洗脱,弃去,继用 70%乙醇 150mL 洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至 2mL 量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得供试品溶液。2.2.4 标准曲线的制备 用移液管分别精密取 1.0、2.0 、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 黄芪甲苷对照品储备溶液置 10mL 容量瓶中,加甲醇定容,分别得到浓度为 0.06、0.12、0.18、 0.24、0.30、0.36 mg.mL-1 的标准品溶液,用 0.45m 微孔滤膜滤过进样 20
11、L,在给定色谱条件下进行测定。以进样量的常用对数值(x)为横坐标,蒸发光峰面积的常用对数值(y)为纵坐标,绘制标准曲线,其回归方程为: y = 0. 986 +1. 835x, r= 0.9994,黄芪甲苷在 1.27.2g 的范围内呈良好的线性关系。 2.2.5 含量测定： 精密吸取供试品溶液，按上述方法测定，计算样品中的黄芪甲苷含量，再计算黄芪甲苷的提取率。2.3 淫羊藿苷含量的 HPLC 测定 4：42.3.1 色谱条件：采用 ODSC18（150mm6mm, 5m）色谱柱，以乙腈水（30：70）为流动相，检测波长 270nm，流速 1.0mL.min-1，进样量 10L。色谱图见图 2
12、。aba-对照品 b-供试品图 2 淫羊藿苷色谱图2.3.2 对照品溶液的制备：精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每 1mL 含113.6g 的溶液，即得。2.3.3 供试品溶液的测定：准确量取每次实验所获得的离心后药液体积，从中精密量取5mL，再向其中精密加入 5mL 无水乙醇，定容成 10mL，静置，取上清液适量过 0.45m 微孔滤膜，弃去初滤液，收集续滤液，作为供试品溶液。2.3.4 标准曲线的制备：精密移取淫羊藿苷对照品溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL 置10mL 量瓶中,加流动相配置成一系列浓度的溶液，过 0.45m 微孔滤膜，在给定的色谱条件下,分别进样 1
13、0L，测得峰面积，以对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线,得回归方程：y=21.133x+17.767（=0.9999），表明淫羊藿苷在22.72113.6g.mL -1范围内呈良好的线性关系。2.3.5 含量测定： 精密吸取供试品溶液，按上述方法测定，计算样品中的淫羊藿苷含量，再计算淫羊藿苷的提取率。3 健肾片水提取工艺的优化研究3.1 黄芪的形状对黄芪甲苷的提取率的影响为提高黄芪甲苷的提取率的同时节约生产成本，我们以黄芪甲苷的提取率为指标，对5提取前的黄芪炮制的形状进行考察：取黄芪净药材四等份，分别粉碎成粗粉、切厚片(24mm)、切段（1015mm）和切段（510mm），
14、各加 10 倍量水提取两次，每次2h。测定提取液中黄芪甲苷的提取率，结果见表 1。表 1 不同黄芪形状对黄芪甲苷提取率的影响黄芪的形状 黄芪甲苷的提取率(%)段 55.43段 67.79厚片 68.37粗粉 68.98结果表明，随着黄芪形状的减小，黄芪甲苷的提取率相应的增加，当黄芪的形状为段时，再减小黄芪的形状对黄芪甲苷的提取率的影响就减小，且相差较小。结合生产实际，选择黄芪的形状为段较为适宜。3.2 黄芪、淫羊藿等药材提取工艺技术条件的研究处方中黄芪（生）、淫羊藿、茯苓三味药材主要含有黄酮类、多糖类化学成分，易溶于水，故对其进行水煎煮提取工艺的考察。工艺研究中要求提高有效成分的含量，而降低出
15、膏量，减少无效杂质的溶出。3.2.1 正交试验设计 用 L9（3 4）正交表，以提取液中黄芪甲苷和淫羊藿苷的得率及干膏收率为指标，对影响水煮工艺的主要因素即加水量、提取次数、提取时间进行考察。根据前期预实验的结果，拟定因素水平见表 2。表 2 正 交 因 素 水 平 表因素 A B C水平 提取次数（次） 提取时间(h) 加水量（倍）1 2 1.5 62 3 2.0 83 4 2.5 10按处方比例平行称取各味药材，共称取 9 份，每份 332.5 g，按表 3 安排试验，药材加水煎煮，合并提取液，冷藏静置，5000r.min -1离心，得药液备用。3.2.2 数据处理与工艺优选 用综合加权评
16、分法，评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化,再权衡 3 个指标的轻重,采取加权的方式,综合评价提取效率。以综合评分值进行正交试验结果和方差分析，正交试验结果见表 3，方差分析结果见表 4。表 3 L9（3 4）正交试验结果试 A B C D 出膏率 淫羊藿苷 黄芪甲苷 综合评分6验号 (X%) 提取率(Y%)提取率(Z%) (W%)1 1 1 1 1 26.65 73.29 63.22 95.172 1 2 2 2 28.53 76.01 66.17 99.683 1 3 3 3 28.99 66.85 53.56 87.564 2 1 2 3 28.74 75.94 65.45 99
17、.365 2 2 3 1 24.10 64.36 54.84 83.656 2 3 1 2 23.52 60.90 53.12 80.397 3 1 3 2 26.46 67.88 60.91 90.808 3 2 1 3 23.82 67.10 64.75 90.899 3 3 2 1 25.98 70.88 66.12 95.19K1 282.41 285.33 266.45 274.01K2 263.40 274.22 294.23 270.87K3 276.88 263.14 262.01 277.81R 6.34 7.40 10.74 2.31注:W%= X/干浸膏最大得率 0.2
18、100 + Y/淫羊藿苷最大提取率 0. 4 100 + Z/黄芪甲苷最大提取率 0.4 100表 4 方差分析表方差来源 离差平方和 自自由度 均 方 F 值 P 值A 63.74 2 31.87 7.92B 82.07 2 41.03 10.19C 203.29 2 101.64 25.25 0.05误差 D 8.05 2 4.03 1.00注 ： F0.05(2,2)=19.00 F0.01(2,2)=99.00 3.2.3 优选提取工艺确定 由表 3 中的直观分析可知，按综合评分标准进行评判时，A 1 A3 A2，B 1 B2 B3，C 2 C1 C3。由表 4 可知各因素影响主次关系
19、为 C B A，并且可知 C因素对提取工艺有显著性影响(P0.05)，所以从生产实际和经济因素综合考虑，我们选用最佳提取工艺为 A1B1C2，即用 8 倍量水提取 2 次,每次 1.5 h。3.2.4 工艺验证 为验证优选工艺的可靠性和重复性, 选择黄芪的形状为段（510mm），按最佳工艺平行制备 3 份中试样品,测定淫羊藿苷和黄芪甲苷的提取率及干膏率，结果见表 5。可见按最佳工艺进行提取, 淫羊藿苷和黄芪甲苷提取率均处于较高水平,表明该工艺合理可行,具可操作性和重复性。 表 5 验证实验结果序号 浸膏得率(%) RSD(%) 淫羊藿苷得率(%) RSD(%) 黄芪甲苷得率(%) RSD(%)
20、71 25.58 73.86 65.752 26.42 1.62 74.05 1.11 66.40 0.813 26.06 75.38 66.814 讨论本试验在正交设计中以淫羊藿苷、黄芪甲苷含量和干浸膏得率作为评价健肾片的提取工艺的客观指标。结果表明，加水量对提取工艺有显著影响，煎煮次数、煎煮时间对提取效果影响不大。通过方差分析和 K 值的综合考虑，根据生产实际情况，优选的最佳提取工艺为 8 倍量水煎煮 2 次，每次 1.5h。试验中还考察了黄芪炮制的形状对黄芪甲苷含量的影响，选择黄芪的形状为段（510mm）为宜。优选的工艺便于进行大生产,且批间质量稳定。本实验采用高效液相色谱法测定健肾片中黄芪甲苷、淫羊藿苷的含量，本法具有灵敏度高、操作简单、分离效果好等优点，可作为质量控制的定量指标。参考文献:1 王昌林,李 昱,王粤新.淫羊藿及其有效成分的药理研究概况J.中国中药杂志,1998,23(3):183185. 2 李勤,刘宏.黄芪的药理作用及临床应用J .医学综述,2004,10 (10 ):634.3 曹斌，孙翠，赖其瑞，等.抗复感颗粒的提取工艺研究 J.中国实验方剂学杂志,2010,16 (7):69.4 王洪锐，杨帆，陈健勇,等.正交设计试验法优选淫羊藿提取工艺条件 J.广东药学院学报,2003,19(1) :78.
