1、降糖药二甲双胍对甲状腺未分化癌细胞增殖及凋亡的作用郏文亭 1，兰玲 2，钱玮 1，杨雪阳 1，郑旭琴 1，徐宽枫 1，崔岱 1*（ 1 南京医科大学第一附属医院内分泌科，江苏 南京 210029； 2 北京积水潭医院内分泌科，北京 100035）摘要目的：研究二甲双胍对甲状腺未分化癌细胞增殖及凋亡的作用，初步探讨其作用机制。方法：以不同浓度二甲双胍作用于未分化癌 SW1736 细胞，MTT 法检测其增殖，流式细胞术分别检测细胞周期和凋亡情况。结果：二甲双胍可显著抑制 SW1736 细胞增殖，其抑制作用呈剂量依赖性，并随着作用时间的延长抑制作用逐渐增强，于 72 小时达到最大抑制效果。流式细胞检
2、测结果显示二甲双胍可阻滞未分化癌细胞周期至 G0/G1 期；并可促进肿瘤细胞凋亡，随着二甲双胍作用浓度的递增，肿瘤细胞的凋亡率逐渐增加，20mM 二甲双胍作用 48 小时后，可使 SW1736 细胞凋亡率从 8.3%增加至 13.3%，与对照组相比，有显著统计学差异。结论：二甲双胍可抑制甲状腺未分化癌细胞的增殖活性，阻滞细胞周期进程，诱导细胞凋亡，为甲状腺未分化癌的治疗研究提供了新的方向。关键词 二甲双胍；甲状腺癌；增殖；凋亡中图分类号The effect of metformin on proliferation and apoptosis of human anaplastic thyro
3、id carcinoma cellsJia Wenting1, Lan Ling2, Qian Wei1, Yang Xueyang1 , Zheng Xuqin1 , Xu Kuanfeng1 , Cui Dai1（ 1Department of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of NJMU，Nanjing 210029； 2Department of Endocrinology，Beijing Jishuitan Hospital，Beijing 100035）AbstractObjective: To investigate th
4、e effect of metformin on proliferation and apoptosis of human anaplastic thyroid carcinoma cells, and explore the underlying mechanisms. Methods: Human anaplastic thyroid cancer cell line SW1736 was *通讯作者 E-mail：cui_treated with different doses of metformin. MTT assay was used to detect proliferatio
5、n viability of cell line. Cell cycle progression and apoptosis were analyzed by flow cytometery Results: Metformin significantly inhibited the growth of SW1736 cells in a time- and dose-dependent manner with a maximal effect at 72 h. And cell cycle was arrested to G0/G1 phase by metformin. Furthermo
6、re, metformin also enhanced apoptosis of SW1736 cells in a dose-dependent manner. Addition of 20 mM metformin increased the percentage of apoptotic cells from 8.3% to 13.3% in SW1736 cells. Conclusion：Metformin can inhibit proliferation, inhibit cell cycle progression and induce apoptosis of thyroid
7、 carcinoma cell line. Therefore, it may be a potential therapeutic agent for the treatment of human anaplastic thyroid carcinoma.Key words metformin ; thyroid carcinoma; proliferation; apoptosis甲状腺肿瘤是内分泌系统最常见的肿瘤，近年来已成为恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤之一 1,其中未分化癌发展迅速，易早期发生侵袭转移，常规治疗无效，患者中位生存期往往只有 6 个月。二甲双胍是 2 型糖尿病患者一线口
8、服降糖药物，近来因其抗肿瘤作用而获得广泛关注，研究发现二甲双胍治疗可降低糖尿病患者总体死亡率及癌症死亡率 2，同时亦有研究报道二甲双胍可抑制多种肿瘤细胞的生长。因此，本研究旨在观察二甲双胍对甲状腺未分化癌细胞增殖和凋亡的作用，初步探讨其作用机制，为进一步深入研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料人甲状腺未分化癌细胞株 SW1736 由德国柏林洪堡大学夏洛特医学院 Derwahl 教授惠赠。人甲状腺组织标本取自就诊于南京医科大学第一附属医院甲状腺外科的甲状腺结节患者手术切除标本，参照文献方法分离提取得到原代甲状腺细胞 3。DMEM 培养基、非必需氨基酸及胎牛血清购自美国 Gibco 公司；二甲
9、双胍（Metformin ）购自美国 Sigma-Aldrich 公司；MTT 购自合肥BIOSHARP 生物科技公司， DMSO 购自美国 Sigma 公司；细胞周期检测试剂盒和 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。1.2 细胞培养SW1736 细胞和原代甲状腺细胞常规培养于含 10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100U/ml 青霉素、100ng/ml 链霉素的 DMEM 培养基中。1.3 MTT 检测细胞增殖活性取对数生长期细胞，以 3-9103 个/孔接种于 96 孔培养板中，分别以终浓度为 0、1、2.5、5、10、20、40、50mM 二
10、甲双胍培养液培养 24h、48h 及 72h后，每孔加入浓度为 5mg/ml 四唑盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ,MTT)溶液 20ul，37孵育 4h；小心吸弃孔内培养液，每孔加入 150ul DMSO，轻微震荡 10min 使结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪于波长 492nm 处检测吸光度值（A） ，每浓度组 6 孔，实验至少重复 3 次。结果以细胞活力比率表示，Relative Cell Viability（ %）= （A n/A0）100%，其中 An 表示实验组吸光度值，A 0 表示对照组吸
11、光度值。1.4 流式检测细胞周期取对数生长期的细胞，以 2105 个/皿均匀接种于直径为 6cm 的培养皿中，24h 后换用终浓度为 0、5、10mM 的二甲双胍培养液，48h 后胰酶消化处理各组细胞，PBS 洗 3 次，加入 1ml -20预冷的 75%乙醇固定过夜，PBS 洗 2 遍后加入 100ul RNase A 37水浴 30min，再加入 400ul PI（Propidium iodide，碘化丙啶）染液混匀，4避光孵育 30min，流式细胞仪检测细胞周期。实验重复 3次。结果以处在各个细胞周期的细胞百分数(%)表示。1.5 流式检测细胞凋亡取对数生长期的细胞，以 4105 个/皿
12、均匀接种于直径为 6cm 的培养皿中，24h 后换用终浓度为 0、10、20mM 的二甲双胍培养液，48h 后胰酶消化处理各组细胞，PBS 洗 2 次，取细胞沉淀加入 250ul Binding Buffer 悬浮细胞，在悬液中加入 2.5ul Annexin V-FITC，2.5ul PI，2-8避光孵育 15min，流式细胞仪检测。实验重复 3 次。1.6 统计处理应用 SPSS18.0 统计软件，计量资料用 S 表示，多组比较采用多因素方X差分析，两两比较采用 Bonferroni 或 Dunnett T3 法，P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 二甲双胍抑制甲状腺未分化癌细
13、胞增殖将不同浓度的二甲双胍分别与 SW1736 细胞作用 24h、48h 和 72h 后行MTT 实验，结果显示二甲双胍可显著抑制 SW1736 细胞增殖，且随二甲双胍浓度的增加抑制作用呈剂量依赖性增强；同时随着二甲双胍对 SW1736 细胞作用时间的延长，二甲双胍对其增殖的抑制作用也越明显，与 24h 及 48h 相比，二甲双胍处理 72h 对 SW1736 细胞抑制作用最强，与对照组相比，有显著统计学差异（图 1） ；二甲双胍作用于 SW1736 细胞 72h 后其半数抑制浓度（the half maximal inhibitory concentration，IC50)为 13.094.
14、00mM，48h 为33.445.98mM。而在原代培养的甲状腺细胞中，二甲双胍对细胞生长无明显抑制作用，仅当二甲双胍浓度增加至 40mM 以上时，对原代培养的甲状腺滤泡细胞的增殖有轻微的抑制作用。图 1 二甲双胍对 SW1736 和原代甲状腺细胞增殖活性的影响Figure 1 The impact of mefformin on proliferation of SW1736 cells and primary thyrocytesA.不同浓度二甲双胍（0-50mM）分别作用于 SW1736 细胞 24h-72h 后，MTT 法测定细胞活力比率；B.不同浓度二甲双胍作用于原代甲状腺细胞 72
15、h 后，MTT 法测定细胞活力比率。每个浓度设 6 个复孔，实验至少重复 3 次（与对照组相比，*, P0.05；*, P0.01） 。2.2 二甲双胍阻滞 SW1736 细胞周期进程SW1736 细胞加入不同浓度二甲双胍培养 48h 后流式细胞仪检测细胞周期，对照组、5mM 组和 10mM 组 G0/G1 期百分比分别为（54.162.29）%、 （58.031.72）%和（62.252.74）%，S 期分别为（ 39.485.40）%、 （32.970.62）%和（28.872.20）%，G2/M 期分别为（6.353.18）%、 （9.012.25）%和（6.335.19）%；其中与对照
16、组相比，10mM 组 G0/G1 期比率增高，S 期比率下降，差异有统计学意义（ P0.01，图 2） 。结果表明二甲双胍可阻滞细胞周期至 G0/G1 期，抑制细胞周期进程。图 2 二甲双胍对 SW1736 细胞周期的影响Figure 2 The impact of mefformin to cell cycle of SW1736 cellsA.不同浓度二甲双胍作用 SW1736 细胞 48h 后，各组细胞周期情况统计，实验重复 3 次（与对照组相比，*,P0.01 ） ；B. 各组典型流式图。2.3 二甲双胍促进 SW1736 细胞凋亡二甲双胍作用 SW1736 细胞 48h 后，Anne
17、xin V/PI 双染检测细胞凋亡情况。如图 3 所示，二甲双胍作用 48h 后，随着二甲双胍剂量的递增，SW1736 的细胞凋亡率逐渐增加，20mM 二甲双胍作用后可使 SW1736 细胞凋亡率从 8.3%增加至 13.3%，差异有统计学意义（P0.01 ） 。B SW1736control 10mM20mM051015 *MetforinCel apotsi rate(%)A 7.2%2.1%C2.0% 10.%3.2%6.3%10mM20mM图 3 二甲双胍对 SW1736 细胞凋亡的影响Figure 3 The impact of mefformin to apoptosis of S
18、W1736 cellsA.流式细胞散点图，右上象限为晚期凋亡，右下象限为早期凋亡； B.各组统计分析结果，实验重复 3 次（与对照组相比，*,P0.01） 。3 讨论近几十年来，我国糖尿病的患病率显著增加，糖尿病患者数量急剧上升，研究发现糖尿病可增加结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌和非霍奇金淋巴瘤等多种癌症的发生风险 4-7。在 2 型糖尿病患者中甲状腺的体积及甲状腺结节的发病率均高于非糖尿病人群 8。研究者 9推测糖尿病可通过多种途径增加甲状腺癌的发生风险：（1）体重指数增加；（2）高胰岛素水平；（3）促甲状腺激素水平长期偏高；（4）高血糖和高甘油三酯；（5）维生素 D 缺乏；（6）
19、使用胰岛素和磺脲类降糖药物。二甲双胍是 2 型糖尿病患者一线口服降糖药物，可抑制肝葡萄糖的输出，改善外周组织对胰岛素的敏感性、增加外周组织对葡萄糖的摄取及利用。近期因其抗癌作用而获得广泛关注。Bowker 2等的一项大型回顾性研究发现，使用二甲双胍的 2 型糖尿病患者肿瘤相关病死率显著低于磺脲类或胰岛素治疗组。荷兰的一项前瞻性观察研究，随访了 1300 名使用二甲双胍或其他降糖药治疗9.6 年的糖尿病患者，得出与 Bowker 一致的结论，二甲双胍治疗可能降低糖尿病患者的癌症死亡率，并且具有剂量依赖性 10。大量体外研究发现二甲双胍可以抑制包括乳腺、神经胶质、肾脏、胰腺、结肠、卵巢、子宫内膜、
20、前列腺及肺等多种肿瘤细胞系的生长 11。动物实验亦发现二甲双胍可抑制结肠癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌的生长 12-14。本研究发现二甲双胍可抑制甲状腺未分化癌细胞株的增殖活性，并且具有时间和剂量依赖性。目前对于二甲双胍抗肿瘤的作用机制尚未明确，诱导细胞周期停滞可能是其作用机制之一。细胞周期可分为 DNA 合成前期（ G1） 、DNA 合成期（S） 、DNA 合成后期（G2）和有丝分裂期（M） 。G1/S 和 G2/M 转换是细胞周期内两个重要阶段，细胞能否完成分裂周期取决于此。研究发现二甲双胍可阻滞细胞周期的 G0/G1 期、S 期或 G2/M 期，使细胞的增殖停滞，从而诱导细胞凋亡 15。本研
21、究结果显示，10mM 二甲双胍可使 SW1736 细胞阻滞于 G0/G1 期，抑制细胞周期进程，进而抑制其生长增殖；增加二甲双胍浓度至 20mM 后可观察到显著的诱导细胞凋亡的作用。与 Liu16和 Wang17分别在三阴性乳腺癌和胰腺癌中诱导凋亡的研究结果一致。本研究仅在体外水平观察二甲双胍对甲状腺肿瘤增殖和凋亡的作用，且研究中使用的二甲双胍浓度远高于临床糖尿病治疗中所用药物浓度 18。研究 19发现健康受试者每日服用 2550mg 二甲双胍，最大血药浓度约为 1918ng/ml（约0.012mmol/l） 。诚然，体外实验所得结果并不能完全复制于体内研究之中。但体外试验结果仍有重要的临床意
22、义 20，这是由于（1）临床中长期服用二甲双胍可能获得累积抑制效应；（2）组织中二甲双胍浓度远高于其血浆浓度；（3）肿瘤治疗中所需最大耐受剂量可能远高于糖尿病治疗剂量。综上所述，本研究显示二甲双胍可抑制甲状腺癌的增殖，且具有时间和剂量依赖性；并可阻滞细胞周期进程，促进其凋亡。今后将进一步研究其作用机制，为甲状腺癌的治疗寻找新的作用靶点。 参考文献 1. Paes JE, Hua K, Nagy R, et al.The relationship between body mass index and thyroid cancer pathology features and outcomes:
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