肾上腺素ELISA试剂盒.DOC

1、肾上腺素 ELISA 试剂盒(德国 IBL：RE59251)1、应用范围此试剂盒可用于人血清和尿液中肾上腺素的体外定量检测。2、临床意义儿茶酚胺类激素肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺主要由肾上腺髓质、交感神经系统和大脑产生。它们几乎影响所有的组织，并与其它激素和神经系统一起参与各种生理过程的调节。在许多疾病中，儿茶酚胺激素及其代谢产物变肾上腺素和去甲变肾上腺素的分泌量都会增加，因而这些激素可用于疾病的诊断。所以，这些激素的检测对于疾病的诊断及神经系统肿瘤疾病的具有重要意义。它主要用于嗜铬细胞瘤的诊断，当然也用于成神经细胞瘤和神经节细胞瘤的诊断。因为在实验一开始时有提取步骤，用户可使用各种动物材料

2、进行实验。所有动物的儿茶酚胺的化学结构相同，因此此试剂盒可用于测大鼠、小鼠或其它动物。3、实验原理此固相ELISA试剂盒利用的夹心法原理。微孔中包被了羊抗兔抗体。之后加入的液态抗体可以结合到抗原分子的一个抗原决定簇上，而抗原分子可在温育期内结合到固相抗体上。样品中的抗原与酶标二抗一起在微孔内温育，此酶标二抗可结合到抗原分子上的另一不同表位上。加入底物液后，溶液所显示的颜色强度与样品中抗原的量成正比。样品的结果可直接从标准曲线上读取。4、贮存与稳定性试剂盒和运输环境和储存环境温度为2-8，避免热源或太阳直射。样品的储存与稳定性及试剂的准备将在相关章节中阐述。开封的试剂盒在有效期内稳定，前提是要将

3、试剂盒用袋子密封并储存于2-8的环境下。5、样品的采集与储存注意 人体内的儿茶酚氨和间甲肾上腺素的释放会受到一些食品和药物的影响。因此在样品采集前72小时内病人应禁止服用下列食物和药品：维生素B，咖啡，香蕉，甲基多巴，MAO，COMT抑制剂，还有降血压类药物。血浆（EDTA）注意 血液采集后两小时内，将血液样品冷藏于2-8的环境下直致离心获取血浆。注意静脉穿刺采集全血的常规注意事项。从采集到血液样品的那一刻起到检测时都应保持血液样品的化学整体性。不要使用明显溶血、黄疸的和脂血样品。如果样品出现混浊，则在实验前应当离心以除去所有的微粒物质。贮存 2-8 -20稳定性 6h 1个月避免热源或太阳直

4、射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。尿液可以是自然尿液也可使用 24h 尿液。将病人 24h 内的所有尿液都收集到，并混合于含 10-15ml 6N的 HCl 防腐剂的试剂瓶中。贮存 -20稳定性 6 个月避免热源或太阳直射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。6、试剂盒成分注意：试剂盒有足够做96份单孔检测或48份双孔检测所需的试剂成分数量 标志 成分1128MTP 包被板，可拆，微孔中包被了抗兔 IgG（羊，单克隆） 。162.5mlCAL A-F 标准品 A-F，即用肾上腺素:0;1.5;15;50;150ng/ml(0;8;27;82;273;819nmol/L)去甲肾上素:0;5;1

5、5;50;150;500ng/mL(0;30;89;296;887;2955nmol/L)多巴胺:0;12;35;115;450;2250ng/mL(0;78;228;750;2938;14688nmol/L)内含-肾上腺素，-去甲肾上腺素，-多巴胺(有生物活性),0.1M 的HCl122.5mlCONTROL 1+2质控品 1+2即用,内含-肾上腺素，-去甲肾上腺素，-多巴胺(具有生物活性),0.1M 的 HCl,具体浓度及可允许范围请见试剂瓶标签.1250LENZCONJ CONC酶联物 浓缩型（100）内含：碱性磷酸酶标记的抗体，Tris 缓冲液，HCl，0.01%的 NaN32 EXT

6、RPLATE 提取板（微孔板）每板 24 孔，包被了硼酸亲和凝胶。160ml EXTRBUF 提取缓冲液粉红色，即用，内含：0.016%的 NaN3。21.25mlCOMT LYO COMT 冻干粉内含：儿茶酚-氧位-甲基转移酶（猪肝） ，NaN312ml COMT ADD COMT 添加剂内含：人血浆，稳定剂，0.01%硫柳汞。17ml ANTISERUM DO肾上腺素抗血清紫罗兰色，即用，内含：抗肾上腺素抗体（兔） ，缓冲液，稳定剂。21.25mlCOENZ 酶联复合物即用，内含：S-腺苷-L-蛋白酸，稳定剂。13ml ENZBUF 酶缓冲液即用，内含：Tris 缓冲液，HCl，稳定剂。1

7、17ml RELEASEBUF Release 缓冲液黄色，即用，内含：0.1M 的 HCl，指示剂。13ml ACYLREAG 酰化试剂即用，内含：二甲基甲酰胺，乙醇。注意：有毒，高可燃性。150ml WASHBUR CONC洗涤液 浓缩型（10）内含：Tris 缓冲液，HCl，吐温，0.2%的 NaN319 PNPP SUBS PNPP 底物片内含：对硝基苯磷酸（PNPP）127ml PNPP BUF PNPP 底物缓冲液即用，内含：二乙醇胺，水，0.05%的 NaN3115ml PNPP STOP PNPP 终止液即用，内含：1M 的 NaOH，0.25M 的 EDTA3 FOIL 粘性

8、金属板7、实验所需器材（但试剂盒不提供）1） 移液器（10；10-100；100-1000L）2） 轨道摇床（200-900rpm）3） 旋涡混合器4） 带储器的 8 通道移液器5） 洗涤瓶，自动或半自动包被板清洗系统6） 酶标仪7） 双蒸水或去离子水8） 吸水纸，取样吸头，计时器8、实验前说明注意 用于 96 人份检测色试剂盒成分可分成两次进行。 ，下列所述体积为做 48 人份时所需要的量。8.1 样品的稀释如果样品中肾上腺素浓度高于最高标准品的应按照下列所述进行稀释：样品 待稀释 稀释液 备注 血浆 肾上腺素浓度高于最高标准品中肾上腺素的浓度 双蒸水 提取步骤前尿液 肾上腺素浓度高于最高标

9、准品中肾上腺素的浓度 0.1N 的 HCl 提取步骤前8.2 样品、标准品和质控品的提取（提取板）1） 将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各 20L 和 500L 血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外，在所有的微孔中加入 500L 双蒸水以消除体积差别。2） 在每一微孔中加入 1000L 提取缓冲液3） 盖板。在轨道摇床（600-900rpm）上 18-25的环境下提取 30min。在提取过程中，液体的表面应该会浸湿粘性金属板，但液体的量不能超过微孔的 2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。4） 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。5） 每孔加入 2m

10、l 双蒸水6） 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25的环境下振荡 5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。7） 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。8） 每孔加入 150L 提取缓冲液，再向每孔中加入 50L 酰化试剂，立即混合均匀。9） 在轨道摇床（400-600rpm）上 18-25的环境下提取 20min。 （无需盖板）10） 快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。11） 每孔加入 2ml 双蒸水。12） 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25的环境下振荡 5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。13） 移去

11、粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。14） 每孔加入 300L Release 缓冲液。15） 在轨道摇床（400-500rpm）上 18-25的环境下振荡 30min。 （无需盖板）已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话，您可将提取板用粘性金属板盖好，在2-8的环境下可存放一夜。9、实验步骤9.1 COMT 酶溶液的准备注意：COMT 酶溶液应在使用前直接临时配置。在 COMT 冻干粉中加入 1.25ml 双蒸水，充分混和。再加入 1.25ml 酶联溶液，然后再加入 1.25ml 酶溶液和 0.40ml COMT 添加剂以充分混合溶解的 COMT 试剂*，COMT 酶溶

12、液最后的体积为每支 4.15ml。一支可做 48 人份。溶液可用旋涡混合器混合，但要避免气泡产生，配置好的 COMT 溶液可在室温下稳定存放 1 小时。*如果只需要一定量的 COMT 溶液，则剩余的 COMT 溶液应立即冻存于-20的环境下。COMT 溶液可在此环境下稳定存放 1-2 个月。9.2 样品、标准品和质控品的酶分化注意如果要检测肾上腺素和去甲肾上腺素，我们建议您先检测肾上腺素。如果使用自动置换型衣液器加样，请将取样吸头内的残余液体加入到提取板的相应微孔内，否则剩余的提取液不够去甲肾上腺素检测用。将提取板放到有一定坡度的位置上。实验开始前，确定好肾上腺素和去甲肾上腺素的检测孔并标记好

13、。9.3尿液与血浆中的甲肾上腺素1 在每一微孔内加入25ul临时配制的COMT酶溶液，轻轻振板以使溶液混合均匀。2 将提取好的标准品、质控品和样品分别25ul加入到相应的微孔内。在此步骤中，我们可以将取样吸头直接深入到COMT溶液里。加样后，溶液颜色变成粉色，轻轻振板以使溶液混合均匀。3 向每一微孔中加入50ul甲肾上腺素抗血清（绿色）。4 盖板，在轨道摇床上（400-600rpm）18-25的环境下孵育120min。8.4 冻干粉或浓缩成分的准备稀释 成分 稀释液 比例 备注 贮存 稳定性20ml 洗涤液 180ml 双蒸水 1：10 充分混合 2-8 4W60L 酶联物 6ml 洗涤缓冲液

14、（已稀释好）1：101临时配置，仅能使用一次，混合时避免气泡产生18-25 30min4 PNPP 底物片10.7ml PNPP 底物缓冲液临时配置，仅能使用一次18-25 10min9.5 ELISA 实验步骤1） 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用 250-300ul 稀释好的洗涤液洗板 4 次。最后在吸水纸上拍干以除去残余液体。2） 在每一微孔中加入 100ul 临时配置好的酶联物。3） 盖板，在轨道摇床上（400-600rpm）18-25的环境下孵育 60min。4） 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用 250-300ul 稀释好的洗涤液洗板 4 次。最后在吸水纸上拍干一除去残

15、余液体。5） 如果可以的话，使用 8 道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液的时间间隔应当相同，使用自动置换型移液器并避免气泡产生。6） 在每一微孔中加入 200ul 底物液。7） 不要盖板，在轨道摇床上（400-600rpm）18-25的环境下孵育 60min。8） 在每一微孔内加入 50ulPNPP 终止液以终止酶反应。轻轻振板以使溶液混合均匀。9） 加终止液后 60min 内 405nm 处读取 OD 值。10、期望值实验结果不能当作判断任何治疗结果的唯一因素，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值（5%-95%） ，建议每个实验室读确定自己的正常值范围：尿液 血浆g/d nmol/d pg/mL nmol/L去甲肾上腺素 20 110 125 0.68本译文仅供参考，详情请以原文为准。中国独家总代理：深圳市科润达生物工程有限公司办公地址：深圳市蛇口工业区太子路 18 号海景广场 11C 研发基地：深圳市蛇口沿山路 10 号 6 层 电话：0755-26814430,26680196 邮政编码：518067 免费电话：800-8306296 传真：0755-26814431