1、1项目名称HSV 携带 BDNF 基因重组载体对抑郁症治疗的实验性研究项目摘要抑郁症是一种慢性的反复发作的脑疾病，影响到全球 20%的人群。目前抑郁症的发生机制尚未完全清楚，但研究表明，大脑内单胺类递质、 神经营养因子、神经再生等因素与抑郁症的发生和治疗密切相关，药物治疗和心理治疗都已成型很久，但治疗效果不佳，而且上述的多种方法，一旦阻断神经元再生的信号传导，就失去的治疗效果，随即以提高 BDNF 水平来治疗抑郁症的基因治疗法和干细胞移植法开始成为研究热点。脑源性神经营养因子（BDNF）是一种在中枢神经系统中发挥引导神经干细胞增殖分化的细胞因子，BDNF 水平的高低和抑郁症的发病情况有着密不可
2、分的关系，且研究证明 BDNF 水平的提高可以极大的缓解甚至治愈抑郁症的病症，且 BDNF 为大分子蛋白质，较难通过血脑屏障， 本实验具体分为多种慢性应激刺激构建抑郁症大鼠模型，基因工程技术构建 HSV-BDNF 基因重组载体，以及体外神经元转染实验和体内脑定位注射实验。通过以上科学的实验和数据分析论证基因治疗抑郁症的可行性，评估基因治疗抑郁症的效果，为以后临床上的应用留作理论基础。2目录一、立论依据 .51.研究意义: .52.国内外研究现状及发展动态分析 .52.1 化学药物治疗 .52.2 心理治疗 .52.3 经颅磁刺激 .52.4 电休克治疗： .63.研究基础： .63.1 抑郁症
3、大鼠模型的构建 .63.2HSV-1 病毒载体的选用： .63.3BDNF（脑源性神经营养因子）基因的选用 .74.参考文献: .7二、研究方案 .101.设计思路 .102.研究技术路线: .112.1 实验准备： .112.2 体外实验 .112.3 体内实验 .123.研究内容： .124.实验材料： .124.1 实验动物 .124.2 实验器材 .124.3 实验试剂 .135.抑郁症 SD 大鼠模型构建 .136.构建稳定的 HSV 扩增子载体-BDNF 基因重组载体 .136.1 目的基因的获取 .136.2 HSV-BDNF 重组质粒构建 .146.3 HSV 病毒包装与细胞感
4、染 .157.体外实验 .157.1.海马体神经元和海马体神经前体细胞的提取： .157.2 病毒重组载体转染： .167.3 细胞培养及结果检测： .168.体内实验 .188.1 大鼠分组： .188.2 大鼠海马体齿状回颗粒层定位注射： .198.3 SD 大鼠培养及数据检测： .198.4 强迫游泳实验和数据记录： .199.可行性分析： .209.1 理论可行 .209.2 实际可行 .2010.创新性分析： .2011.预期研究结果 .213一、立论依据1.研究意义:随着现代城市生活节奏不断地加快， 人们压力越来越大， 抑郁症的发病率也在逐年递增。抑郁症是一种高患病率、高负担、高自
5、杀、易复发、易自残的常见精神疾病， 以明显而持久的心境低落为主要表现，可伴有相应的思维和行为改变。 抑郁症的终身患病率为 10% 20% ， 时点患病率为 2% 5% 。 保守估算， 全世界有1.2 2 亿患者，我国至少有 2500 万抑郁症患者 1 。 WHO 的全球疾病医疗负担预测， 到 2020 年抑郁症将成为第二大负担源，中国抑郁疾病的医疗负担将位于恶性肿瘤、心脑血管和呼吸系统疾病之前。目前对抑郁症的治疗虽然取得了一定临床疗效， 但还存在治愈率偏低、 复发率较高等问题。这可能与抑郁症的发病机制仍未完全阐明有关， 需要进一步探索抑郁症的发病机制和新的治疗手段。2.国内外研究现状及发展动态
6、分析：2.1 化学药物治疗：2.11 单胺氧化酶抑制剂、 可逆性选择性单胺氧化酶抑制剂。2.22 三环类抗抑郁药 三环类抗抑郁药(TricyclicAntidepressants，TCAs)。2.23 四环类抗抑郁药。2.24 选择性 5 羟色胺再摄取抑制剂。2.25 选择性 5 羟色胺及去甲肾上腺素再摄取抑制剂。2.26 肾上腺素能和特异性 5 羟色胺能抗抑郁药。2.27 其它非典型抗抑郁药物。一般药物治疗都要选用长期的服药，2会带来一些生理上的副作用，包括体重增加，失眠，虚弱，和性功能障碍等副作用。2.2 心理治疗：心理治疗常用于有明显社会因素作用的抑郁发作患者及轻度抑郁症患者或者恢复期患
7、者。常用的心理治疗方法有心理支持治疗、 认知疗法、 行为疗法、 人际心理治疗、 婚姻及家庭治疗等。抑郁症的心理治疗虽然在临床上取得了一定的疗效 3，但存在治疗方案不统一， 疗程不确定， 且心理治疗的实施者大多为非临床心理医生或者精神科医生4 ， 这些问题导致实施心理治疗缺乏统一的规范标准，疗效评估存在差异， 同时也限制了抑郁症的心理治疗理论的发展。2.3 经颅磁刺激：4应用脉冲磁场作用于脑组织，5 诱发出一定的感应电流， 使神经细胞去极化，产生诱发电位，对抑郁症具有潜在治疗作用。但存在着研究机制不完善，治愈率比较低的弊端。2.4 电休克治疗：电休克治疗(Electroconvulsive Th
8、erapy，ECT)是通过短暂适量的电流刺激大脑， 引起病人意识丧失， 皮层广泛性脑电发放和全身性抽搐， 以达到控制精神症状的一种治疗方法。副作用多，如激烈抽搐所致肌肉疼痛，明显的恐惧感、痛苦体验等。对于 MECT 作用机制目前尚不明确， 国内外研究仍处在不断探索中 6 。总的来说迄今对抑郁症的诊治尚存在一系列的问题及不足：首先由于缺乏客观准确的诊治指标加以认识不足，许多患者漏诊，直至出现严重体征或自杀趋向才被发现；其次现在抗抑郁药只能使约 70%临床就诊患者病情改善，同时需要长期维持治疗以减少抑郁症的反复发作，第三积累抗抑郁药虽然临床应用已数十年，起作用环节基本明确，但事实上传统的单胺类神经
9、递质与受体理论并不能充分解释抗抑郁药的临床滞后效应，及患者的症状体征常需要在持续应用抗抑郁药 3-4 周后方出现改善；故推测单胺类神经递质的改变可能仅是抑郁发生机制中的一个信号环节或原因之一，其主要效应尚需经有一系列下游信号途径的介导。7总之，对抑郁发生的细胞分子机制与临床诊治手段，尚需深入研究探寻。近年来，基因技术的进步使得抑郁症的治疗有了新的进展，转基因技术已被应用于治疗多种中枢性神经疾病，有望在治疗抑郁症上做出新的进展。3.研究基础：3.1 抑郁症大鼠模型的构建：应激抑郁模型造模手段与临床抑郁症患者的病因有相似性， 是目前最常用的抑郁动物模型8 。抑郁症大鼠模型的构建是有关抑郁症实验开展
10、的基础，目前抑郁症大鼠模型已被广泛应用于各种抑郁症试验中。3.2HSV-1 病毒载体的选用：单纯疱疹病毒 1 型（ herpes simplex virus type-1 ， HSV-1 ）具有强神经亲嗜性，已经被广泛的用来构建各种基因转移载体，它具有以下特点： 装载容量大，可高达 150 kb ； 宿主细胞广泛，既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞，包括中枢神经系统； 不含编码病毒结构蛋白的基因等优势。9 这些优势使得 HSV-1 扩增子载体成为一种十分有力的神经系统疾病基因治疗载体。并且 HSV-1 病毒5载体已经被用于帕金森病，缺血性脑损伤，遗传性共济失调，阿尔茨海默病等多种中枢神经性疾病
11、的基因治疗。103.3BDNF（脑源性神经营养因子）基因的选用：抑郁症发生的神经营养学说提出后，各项研究已证实 ,BDNF 能刺激新生神经元突起的生长, 对新生神经元的进一步发育和成熟有着重要的作用和意义 ;BDNF 还可能通过上调 ( d o u b l e c o r t i n , D C X ) 阳性细胞表达 ,从而增加神经元前体细胞的分化和迁移,进而促进神经细胞的发育。11由此可见 , BDNF 对神经的结构可塑性和功能可塑性都有调节作用,且大鼠的 BDNF 的脑定位注射实验和转 BNDF 基因的干细胞移植大鼠脑内实验均已证实 BDNF 对治疗抑郁症有着显著的效果。7且有研究表明,外
12、周循环中的 BDNF 可以通过高效、有饱和性的转运系统穿过血脑屏障,也可以从脑中释放到血液中12。Karege 等13发现成年大鼠脑组织和血液中的 BDNF 呈现相似的数量级水平，血清和大脑皮质中 BDNF 水平有正性相关关系。因此,血清 BDNF 水平能够反映大脑中 BDNF 的水平，便于检测和反应实验结果。基于以上实验基础，本课题选用通过强迫性游泳和慢性应激的方法能建立稳定的抑郁症动物模型，利用 HSV-1 病毒载体和 BDNF 目的基因构建 HSV-BDNF 重组载体，利用体外培养神经干细胞分化模型证明 HSV-BDNF 重组载体转染对神经细胞有保护作用并且 BDNF 能显著促进神经干细
13、胞的增殖和分化。最后通过大鼠脑部海马体齿状回定位注射 HSV-BDNF 重组载体进行体内实验验证转基因治疗抑郁症的可行性及对治疗效果进行评估。本项目为抑郁症的治疗提供了新的思路和手段，为以后在临床上的使用奠定理论基础。4.参考文献:1 孙凤艳 . 医学神经生物学 M. 第 1 版 . 上海：上海科学技术出版社， 2008:305 310.2 Demyttenaere K : J Affect Dis. 1997; 43: 27 393牛慧明， 谢玉凤， 裴根祥 舍曲林联合心理治疗抑郁和焦虑障碍共病临床研究 J 临床心身疾病杂志， 2006， 12(4):250 2524邱建忠， 李晓铭， 李春
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15、:83 857 杨忠 BDNF 在抑郁症病程中的变化及其对神经发生影响的实验研究 第三军医大学神经生物教研室 2009.118韩明飞， 高 东， 孙学礼. 应激抑郁动物模型的建立与评价J.华西医学， 2008，23(4):901 902.9 张 桦，史巧娣 HSV-1 扩增子载体对神经系统疾病治疗作用的研究进展 实用医药杂志 2012 年 11 月 第 29 卷 第 11 期 Prac J Med Pharm Vol 29, 201211 No1110 Bowers WJ, Federoff HJ. Amyloid immunotherapy-engenderedCNS inflammatio
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18、、细胞水平客观、高效药效评价模型 浙江大学 200315 Zhu Qian 1 , Zhao Yun-he 1 , Liu Xue-qin 1 , Yang Wu-lin 2 , Lu Li 1 Bromodeoxyuridine assay for detecting the proliferation of neural progenitor cells in mice ages Chinese Journal of Tissue Engineering Research February 5, 2012 Vol.16, No.616 赵娅 ProBDNF 抗体封闭联合 BDNF 过表达对
19、小鼠脊髓损伤修复的影响 昆明医科大学 2013717Porsolt RD, Bertin A, Jalfre M. “Behavioural despair”in rats andmice :strain differences and the effects of imipramine J . European J Phar -macol, 1978, 51( 3) : 291-294.8二、研究方案1.设计思路第一步构建抑郁症大鼠模型，对 SD 大鼠进行多种慢性应激性刺激，然后采用 open-field 法(开场实验 )测定其行为，筛选出构建成功的抑郁症大鼠模型 25 只（18 只用于实验
20、，7 只备用）。第二步构建 HSV-BDNF 基因重组载体，通过科学的实验步骤得到稳定的 HSV 扩增子-BDNF 基因重组载体和 HSV-lac 对照病毒载体（HSV 空载体）用于以下的实验第三步体外实验，体外培养的神经细胞随机分为三组（实验组，阴性对照组，空白对照组），用上步构建的重组载体转染进行实验。后检测结果，记录并分析，为第四步实验作理论基础。第四步体内实验，将第一步中构建的抑郁症大鼠随机分为三组（实验组，阴性对照组，空白对照组），用上述的重组载体进行大鼠脑部海马体齿状回颗粒层定位注射进行实验。后检测结果，记录并分析，评估基因治疗抑郁症的效果。92.研究技术路线:2.1 实验准备：2
21、.2 体外实验：抑郁症大鼠模型构建SD 大鼠海马体神经元和海马体神经前体细胞海马体神经元海马体神经前体细胞实验组阴性对照组空白对照组实验组阴性对照组空白对照组HSV-BDNF基因重组载体转染HSV-lac 空白载体转染加入等量培养液HSV-BDNF基因重组载体转染HSV-lac 空白载体转染加入等量培养液BDNF 浓度检测海马体神经元检测BDNF 浓度检测神经前体细胞增殖检测HSV-BDNF 基因重组载体构建102.3体内实验：3.研究内容：1.抑郁症大鼠模型构建及评估过程2.HSV-BDNF 基因重组载体和 HSV-lac 空载体的构建过程3.HSV-BDNF 基因重组载体在体外对海马体神经元的转染表达及 BDNF 作用效果4.HSV-BDNF 基因重组载体在体外对海马体神经前体细胞的增殖作用5.HSV-BDNF 基因重组载体在大鼠海马体内的转染表达和治疗抑郁症效果分析4.实验材料： 4.1 实验动物健康成年 SPF 级 SD 大鼠 40 只；E15-16 天 SD 孕鼠（健康，清洁级）4.2 实验器材SD 抑郁症大鼠模型实验组阴性对照组空白对照组HSV-BDNF基因重组载体注射HSV-lac 空白载体注射等量生理盐水注射大鼠海马体齿状回颗粒层立体定位注射血清 BDNF 浓度检测大鼠强迫游泳实验时间
