1、1离子色谱法测定大肠癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖付晓伶 1， 周荣耀 *1，潘广文 2(1.上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科，上海，2012032. 戴安中国有限公司应用研究中心上海实验室，上海，201203）摘要：建立了大肠癌患者尿液中甘露醇和乳果糖的高效阴离子交换分离脉冲积分安培（HPAEC-PAD）检测方法。样品经稀释、净化、过滤后进行色谱分析，以氢氧化钠-乙酸钠梯度淋洗液为流动相，流速 1.0 mL/min，采用 Carbopac PA1（250 4 mm）阴离子交换柱分离，脉冲积分安培检测器（PAD）检测，外标法定量。结果表明，甘露醇和乳果糖的的线性范围为 0.2-20 mg/L，相
2、关系数分别为 0.9995 和 0.9998，回收率为 91.7% 102.6%，相对标准偏差均小于 2.09%，检出限为 0.05 和 0.06 mg/L（以信噪比为 3 计） 。该方法前处理简便，灵敏度高，重现性好。用于大肠癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖测定，结果令人满意。关键词：离子交换色谱；甘露醇；乳果糖；尿液1 引言：乳果糖、甘露醇均为不被人体代谢的糖类，在正常情况下，不易被肠道吸收，在尿中含量很少。在病理情况下，肠粘膜受损，细胞间的紧密连接被破坏，细胞间隙扩大，通透性增加，通过细胞旁通道吸收的乳果糖(Latulose,L)量明显增加。而穿过小肠上皮细胞水溶性微孔吸收的甘露醇(Mann
3、itol,M) ，其吸收量变化甚微， L 与 M 的比值增大。L/M 可排除胃排空时间，心输出量，肾排出量及尿液收集等误差对检测结果的影响，能真实地反映肠粘膜屏障通透性变化情况。大手术、创伤、烧伤、感染、脓毒症、肝硬化、放疗和化疗等应激可造成肠屏障结构和功能的损害，而肠通透性是评价肠屏障功能的一个重要指标。甘露醇和乳果糖被证明是能反映肠道屏障功能的有效方法。高效阴离子交换脉冲积分安培分离检测方法（HPAEC-IPAD）目前已经广泛应用于各种糖的分析测定。该方法主要依据糖类在碱性溶液中可呈现离子化状态，不同糖类的离子化程度不同，即 pKa 不同，根据糖类 pKa 的差异以及某些糖类与阴离子交换树
4、脂之间的疏水性相互作用而实现在离子交换色谱柱上的分离。同时糖类的羟基在碱性溶液中具有电化学活性，在外加电压作用下，羟基易在金电极表面发生氧化还原反应，然后根据羟基在金电极表面发生氧化反应产生的电量大小实现检测。该方法具有不用衍生、操作方便、灵敏度高、不使用有毒化学试剂和有机溶剂的优点，对糖类的检出限可以达到 pmol 数量级 1-4。尿液中甘露醇和乳果糖的测定方法有多种，目前以气相色谱法 5及高压液相色谱仪 6,7为主, 常用检测器是 ELSD、MS 和 RID，但它们都存在前处理繁琐、操作复杂或重复性不佳等缺点，特别是灵敏度低，达不到检测要求，且容易受到复杂基体的干扰。离子色谱安培检测分离度
5、好、灵敏度高、比 UV-ELSD 和 UV-RID 法优势明显。于博昊等 8人采用离子色谱的方法曾对幼兔尿样中的甘露醇和乳果糖进行定性定量检测，结果表明，离子色谱法能有效检测两种糖醇，且方便、快捷，具有良好的稳定性和重复性。冯蕾等29人曾建立了固相萃取- 高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法测定癌症患者尿液中异黄蝶呤的分析方法，能去除大量干扰物质，该方法具有灵敏度高、选择性好、对环境造成的二次污染小等特点。因此，本文尝试采用高效阴离子交换脉冲积分安培法分离人体尿液中甘露醇和乳果糖，并应用于大肠癌患者尿液的实际样品测试。2 实验部分2.1 仪器、试剂与材料Dionex ICS-3000 离子色谱仪
6、（美国戴安公司,包括四元梯度泵、金电极和安培检测器） ，Chromeleon 6.8 色谱工作站，Barnstead-Nanopure 纯水机，Anke TDL 80-2B 离心机， CarboPac PA 1(250 4 mm)分析柱，CarboPac PA 1(50 4 mm)保护柱，Onguard RP （ 2.5mL） ，0.22 m 尼龙滤膜过滤头。 甘露醇（Augsburg Germany，批号：C14752000） ；乳果糖（中国药品生物制品检验所，批号：100057-200601） ；50%氢氧化钠（Fluka 公司） 、乙酸钠（生化级，Fluka ） ；实验用水均为大于 18
7、.2 Mcm 的二次去离子水。2.2 样品处理2.2.1 尿液收集大肠癌患者于治疗前 1 天早晨, 排晨尿后，口服测试液 50ml，(乳果糖 15ml，10g，甘露醇 25ml，5g，纯净水 10ml)，连续 6 h 收集尿液, 并计总量, 混匀, 各时段取 1 m l,置于-20的冰箱保存。2.2.2 标准溶液的配制称取标样，用含 20 mg/L NaN3 超纯水配制 1000 mg/L 的甘露醇和乳果糖标准溶液，保存于冰箱冷藏室中。临用时稀释成 100 mg/L，分别准确移取 100 mg/L 的甘露醇和乳果糖标准溶液各 0 mL、0.2 mL、0.5mL、1.0 mL、2.0 mL、5.
8、0 mL、10.0 mL、20.0 mL 于 100 mL容量瓶中，用水准确定容至刻度，配制成 0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L 不同质量浓度的标准工作溶液。2.2.3 供试溶液的配制抽取尿液样品，置于离心机中 10000 r/min 离心 10 min，分别准确移取上清液 1.0 mL，置于 100mL 容量瓶中，加水准确定容至刻度。混匀，溶液先经 On guard RP 柱子过滤，再经 0.22 m 尼龙滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液供色谱测定。2.3 色谱条件3流动相A为超纯水，流动相B为250 mM NaOH, 流动相C 为400 mM NaOAc
9、，梯度洗脱程序为 0-20min，6% B，2% C；20-30 min 80% B，2% C；30-50 min，6% B，2% C。流速为1.0 mL/min；进样体积25 L ；金电极，脉冲积分安培检测，外标法定量。3 结果与讨论3.1 实验条件考察3.1.1供试品预处理方法考察根据文献 10报道，尿液的组分复杂，健康人的尿液有形成分包括红细胞、白细胞、上皮细胞( 鳞状和非鳞状) 、精子细胞、酵母菌、管型(透明、非透明) 、结晶(草酸钙、尿酸、三磷酸盐) 。为去除可能存在有机物和固体颗粒（主要是草酸钙结晶，尿酸结晶，三磷酸盐结晶，酵母菌，透明管型，非透明管型等成分） ，尝试采用固相萃取技
10、术，减少杂质对甘露醇和乳果糖色谱峰的影响。经实验，提取液经Onguard RP 柱子纯化后再进样分析，甘露醇和乳果糖的附近无杂质干扰，加标回收率分别达到91.7%和102.6%，说明甘露醇和乳果糖在Onguard RP柱子上基本无保留。3.1.2 色谱条件考察 将离子交换-脉冲安培检测应用于幼兔尿液中甘露醇与乳果糖含量测定的有文献报道 8，但未考察乳糖的干扰。乳糖在牛奶等乳制品中的含量很高，患者食用奶制品后，尿液中多数含有乳糖，乳糖和乳果糖结构类似，在色谱柱上的保留行为接近，很容易造成对乳果糖测定的干扰 11。本研究考察了多种色谱条件下乳糖和乳果糖的分离度, 最终使乳糖和乳果糖获得较好的分离，
11、色谱图见图 1：图 1 甘露醇、乳糖以及乳果糖标准溶液色谱图Fig Chromatogram of the mannitol，lactose and lactulose standard solution 1. 甘露醇（mannitol）,2.乳糖(lactose), 3.乳果糖( lactulose）为了排除杂质的干扰，保持色谱条件的稳定性和实用性，综合上述因素，选取了NaOH/ NaOAc洗脱系统，流速为1.0 mL/min的色谱条件。按照上述选定的色谱条件分析样品，甘露醇和乳果糖与其他杂质的分离度良好，乳糖对4乳果糖的测定无干扰。图 2 甘露醇和乳果糖标准溶液色谱图Fig Chromat
12、ogram of the mannitol and lactulose standard solution (1.0 mg/L)1. 甘露醇（mannitol）,2.乳果糖( lactulose）3.2 色谱方法评价3.2.1 线性关系与方法检出限取甘露醇和乳果糖标准工作溶液，按“1.2.4” 节色谱条件进行测定。以峰面积 Y 对质量浓度 X（mg/L）进行线性回归，甘露醇和乳果糖的线性关系分别为 Y=4.1728X+0.6752 （r=0.9995）, Y=0.6515X-0.0309 （r=0.9998 ）. 在测定条件下，甘露醇和乳果糖的方法检出限分别为 0.04 和 0.06 mg/L
13、。3.2.2 方法的重复性 取同一样品，按“1.2.3”节样品制备方法平行处理 8 份样品，按“1.2.4” 节色谱条件测定各样品，考察方法的重复性，甘露醇和乳果糖的保留时间、峰面积、峰高和含量的重复性见表 1。其相对标准偏差，均小于 2.5%。连续 3 天，每天连续将同一标准溶液进样 6 针，考察方法的日间精密度，结果显示甘露醇和乳果糖峰面积的 RSD 为 2.02%和 3.25%，符合测定要求。表 方法重复性实验结果(n=8)Table 1.Reproducibility of Mannitol and Lactulose peaks (n=8)样品名称 保留时间 RSD/% 峰高 RSD
14、/% 峰面积 RSD/%甘露醇 (mannitol) 0.38 0.97 1.83乳果糖（latulose） 0.41 0.86 2.293.2.3 回收率准确移取尿液样品 1.0 mL，分别加入高、中、低三种不同浓度的甘露醇和乳果糖标准溶5液，按“1.2.3”节样品制备方法制备样品，按“1.2.4”节色谱条件测定样品，计算回收率，结果见表 2，各样品的回收率范围为 91.7% 102.6%，相对标准偏差均小于 2.09%。表 样品中甘露醇和乳果糖的回收率（n=6）Table Recoveries of the Mannitol and Lactulose from samples (n=6)
15、被测物 Object原有量Originalmg /L加标量Addedmg /L测得量Foundmg /L回收率Recovery%相对标准偏差RSD%甘露醇 0 0.060 0.055 91.7 2.09乳果糖 0 0.100 0.103 102.6 1.223.3 样品测定按“1.2.3”样品制备的方法，对 10 位患者的尿液样品进行处理，按“1.2.4”节色谱条件测定其甘露醇和乳果糖的含量。结果见表 3、图 3。表 3 10 位患者尿液中甘露醇和乳果糖的含量测定结果Table 3 The concent of the Mannitol and Lactulose in urine of 10
16、 colorectal cancer patientsmannitol mg/L lactulose mg/L样品号测得的量 样品中的含量 测得的量 样品中的含量L/M 比值1 0.71 71.00 2.76 275.92 3.902 9.48 948.33 1.65 165.33 0.173 7.07 706.93 0.91 90.72 0.134 10.33 1033.18 3.12 312.48 0.305 15.84 1584.09 2.66 266.32 0.176 11.55 1155.12 1.90 189.89 0.167 11.58 1158.43 1.98 197.93 0
17、.178 11.52 1151.72 1.88 188.23 0.169 11.58 1158.47 1.90 190.33 0.1610 11.63 1163.46 1.96 196.15 0.176图 4 号尿液样品的色谱图Fig 3 Chromatogram of the Mannitol and Lactulose in urine sample 41. 甘露醇（Mannitol） ，3 乳果糖(Lactulose )4 结论采用高效阴离子交换脉冲积分安培(HPAEC-IPAD) 色谱系统成功地对大肠癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖进行测定，测试结果表明，该方法的准确度、精密度、回收率均较
18、好，满足分析测试要求，检出限低，灵敏度好，是一种简便快速、分离效果良好的分析方法。文献报道 12正常国人乳果糖和甘露醇排除率比值为 0.0260.006，本研究测定了多例大肠癌患者的尿液中 L/M 含量，结果提示大肠癌患者尿液中 L/M 的比值较正常人群明显增加，揭示大肠癌患者的肠粘膜通透性较正常人显著增加，本研究采用高效阴离子交换脉冲安培(HPAEC-PAD)检测方法能灵敏反应大肠癌患者肠粘膜通透性，可以作为临床监测大肠癌患者肠粘膜通透性的有效手段。由于本研究临床样本数有限，有必要扩大样本量，以便进一步揭示不同的治疗手段对大肠癌患者的肠粘膜通透性的改善情况,为大肠癌患者改善肠粘膜通透性的治疗
19、提供实验依据。参考文献1 Liang Lina(梁立娜)，Zhang Ping(张萍)，Cai Yaqi(蔡亚岐)， Mon Shifen(牟世芬) .Chinese J. Anal. Chem.(分析化学 )，2006, 34(10)：137113742 Yaqi Cai，Jingshen Liu，Yali Shi，Lina Liang，Shifen Mou.Journal of Chromatography A，1085 (2005) 98103.3 Yaqi Cai,Yue Cai, Ju Cheng, Shifen Mon, Lu Yiqiang. Journal of Chromat
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24、rectal cancer patient by ion-exchange Chromatography FU XiaoLing 1, ZHOU Rongyao* 1,PAN Guangwen 2(1. ShuGuang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China;2. Shanghai Laboratory of Application and Research Center, Dionex China Limited, Shanghai 201203, China）Abstract: A
25、 new method was developed for the determination of mannitol and Lactulose in urine by ion-exchange chromatography and pulsed integrated amperometric detection. The sample was dilulted with water, purified with On guard RP, filtrated by 0.22 m nylon filter membrane, and then analyzed by Ion-exchange
26、Chromatography. The analytical column was CarboPac PA1(250 mm 4 mm), gradient sodium hydroxide and sodium acetate was used as the amperometric detection. The quantitive analysis of external standard calibration curves was used. The Linear ranges of the method for mannitol and Lactulose were 0.2-20 m
27、g/L (r=0.9995，0.9998). The average recoveries were 91.7%-102.6% with RSDs less than 2.09%. The detection limits were 0.04 mg/L and 0.06 mg/L separately. eluent at a flow rate of 1.0 mL/min. The method is simple, effective, precise, sensitive, reproductive and selective. It can be used to determine the content of mannito and lactulose in the urine of colorectal cancer patient.Key words: ion-exchange chromatography; mannitol ; lactulose; urine作者介绍：付晓伶，女，博士研究生，主治医师，。021-20256515，13917953726。通讯联系人：周荣耀，男，主任医师，从事中医肿瘤内科研究。。021-20256517本文系国家自然科学基金重大研究计划资助项目（No. 90209033)资助
