1、7 高效液相色谱技术（HPLC）,高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离
2、分析课题必不可缺少的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。,7.1 基本原理 加样 流动相 流动相 固定相 流动相 A C B B C A 固定相 柱内填料，流动相 洗脱剂。 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。,按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类： 分配色谱： 分配系数 亲和色谱： 亲和力 吸附色谱： 吸附力 离子交换色谱： 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）： 分子大小而引起的体积排阻,分配色谱又可分为： 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极
3、性。 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。 用的最多，约占6070。固定相（柱填料）： 固定相又分为两类： 一类是使用最多的微粒硅胶； 另一类是使用较少的高分子微球： 优点是强度大、化学惰性、使用pH范围大 (pH=114)； 缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和 凝胶色谱。,最常使用的全孔微粒硅胶（310m）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（OH）而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。 使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是 27.5，若过碱（pH8），硅胶会粉碎或溶
4、解；若过酸（pH1），键合相的化学键会断裂。有些特殊的健合相可以用于pH 911。 键合相使用硅胶作基质的优点是： 硅胶的强度大；微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制；化学稳定性好。,硅胶 ( SiO2n H2O) ： OH OH SiOSi 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物。 最常用的键合相键型是： SiOSiC R1 R1 SiOH + XSiR SiOSiR + HX R2 R2 硅胶 有机硅烷 键合相 X Cl，CH3O，C2H5O等。 R 烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。 R1 、R2 X、CH3等。,最常用的“万能柱”填料为“C
5、18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱7080的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶（2040m）。 按键合到基质上的官能团可分为：反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、 C8、C4等。 正相柱：填料为极性，官能团为 CN氰基、NH2氨
6、基等。离子交换键合相： 阳离子官能团：SO3H磺酸基、COOH羧基等。 阴离子官能团：R4N季铵基、-氨基等。( 由于硅胶基质的键合相只能在pH27.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。),流动相：1. 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃 最常用的流动相组成是：“甲醇H2O”和“乙腈H2O”，由于乙腈的剧毒性，通常优先考虑“甲醇H2O”流动相。2. 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇 最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80的顺、反和邻位、对位异构体仍然要用
7、正相色谱来进行分离。,反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来。流动相的pH对样品溶质的电离状态影响很大，进而影响其疏水性，所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中，经常要加入修饰性的离子对物质，最常用的离子对试剂是三氟乙酸（TFA），使用浓度为0.1，使流动相的pH值为23，这样可以有效地抑制氨基酸上羧基的离介，使其疏水性增加，延长洗脱时间，提高分辨率和分离效果。 完全离子化的溶质，例如强酸或强碱，其在反相键合相上的保留值很低，近于死时间流出，不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷（A）相反的离子（B），
8、称为对离子，加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对，即中性缔合物，从而增强了样品的疏水性，加大了保留值，改善了分离效果。,流动相的选择原则是： 样品易溶，且溶解度尽可能大。 化学性质稳定，不损坏柱子。 不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 粘度低，流动性好。 易于从其中回收样品。 无毒或低毒，易于操作。 易于制成高纯度，即色谱纯。 废液易处理，不污染环境。,7.2 基本参数 1.保留值 进样 t0 tR 保留时间“ tR”：进样至出峰的时间。 死时间“ t0”：不被柱子吸附的惰性物质的出峰时间。 死时间“ t0”的测定通常是使用不被柱子保留而又有紫 外吸收的惰性物质，例如：正相色
9、谱常用四氯化碳， 反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等。,容量因子“ k ”： 或： “ k ”是比“ tR”还常用的保留值，它与柱子的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体企积比）有关。“ k ”又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消除了保留值的波动因素，而平衡常数“ K ”是平衡时物质在两相中的浓度比。 k值的范围： 0.4k2030 k25为佳，过大则耗时太长。,保留体积：VRtRFC ( FC - 流动相的流速 mL/min ) VR 是在 tR 时间内流动相流过柱子的体积。 调整保留时间：tR tRt0 调整保留体积：V
10、R VRVR0tR FC 选择性指标“ ”和相对保留值“” 可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏： 进样 tR(1) tR(2) 相对保留值(分离因子)： ( 1.1为好 ),2.柱效率：定义： 理论塔板数 ： ( 每米柱 ) 标准偏差，曲线拐点处峰宽的 1/2h 2 一半，即峰高0.607处峰宽的一半。 W1/2 为便于测量，改用半峰宽： 1/2h W1/2( 或2t1/2 ) Wb 最常用的计算式： 另一计算式： ( Wb不如W1/2容易测量，因而此式用的较少。),理论塔板高度： ( L 柱长)经验式： H2dP ( dP10 H20 N5万 ) ( dP5 H10 N10万 ) dP柱
11、填料的颗粒直径 柱效的测定和计算： 以反相柱为例，流动相用87(V/V)的甲醇:水，样品用苯、联苯、萘等，加快记录仪的走纸速度，测出半峰宽W1/2，并由走纸速度换算为与 tR 相同的单位 “分” 或 “秒” ，代入公式，计算出柱效N。 提高柱效的方法： 固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。 流动相粘度低。 低流速。 升高柱温。,3.不对称因子“Tf”： 用于形容色谱峰拖尾和前伸的程度，多数为拖尾峰。 h 进样 进样 A B 0.1h 拖尾 前伸 ( A、B如上图所示) 通常 Tf1.21.3 ，若 Tf2 则峰不合格。 峰拖尾的原因是硅胶基质上的SiOH羟基未被全部键合而与溶质发生反应。 改进
12、拖尾要用封尾技术：即用小分子的含甲基的物质再次对硅胶进行键合，封闭硅羟基；还可在流动相中加入带 NH2氨基(对羟基敏感)的物质，将残余的羟基掩闭。,分辨率： tR(1) tR(2) 进样 W1/2(1) W1/2(2) tW1 tW2 4. 分离度 K1和 K3 HPLC的目的和要求是：峰要尽可能窄（W1/2小），峰间距大（tR相差大）。 基线分离度 K1 ： ( 基线分离时用K1。) H h,峰高分离度： ( K31 基线分离，K3 更反映了实际分离度。),5.线速度：溶剂在柱中移动的速度。 mm/sec ( L柱长 t0 死时间) H(m) 粗粒 如右图所示，用实验可找到最佳的线速度： 细
13、粒 即图中的A点：u1 mm/sec 此处不用流量而用线速度，是因为流量与 柱径有关，而线速度与柱径无关。 请记住不同柱内径的最佳流量： A B u(1mm/sec) 柱内径 流量 线速度 5 mm 1.0 mL/min 1 mm/sec ( B奌： u2 mm/sec ) 2 mm 0.2 mL/min 1 mm/sec 1 mm 50 L/min 1 mm/sec 由 “1 mm/sec ” 最佳线速度可计算出适合各种柱径的最佳流量。 由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂贵的乙腈，若用1mm柱，则一个月才用一并。,5.保留值方程： 正相色谱： lnkablnCbcCb 反相色谱： l
14、nkacCb 离子交换色谱： lnkablnCb ( Cb强冲洗剂浓度 ) ( 对于不同溶质 a、b、c 系数不同 ) ( 反相色谱是线性方程 ) 正相色谱： 反相色谱： lnk lnk Cb Cb,lnk lnk 萘 四氢呋喃/水 D 甲醇/水 苯 Cb D Cb (甲醇/水) D点：同样的容量因子，四氢呋喃 D点：萘非极性强，k大，斜率陡 用量少 lnk 甲 lnk 乙 C A B Cb A A D A Cb A点甲、乙二溶质分不开，B点比 A点分不开，要寻找不是交叉点的 C点冲洗剂浓度高，但k小，省时 D点的Cb浓度为分离条件 间，所以选B点好。,所以，改变Cb浓度，保留值k和选择性都改变了，寻找最佳的Cb浓度就是HPLC高效液相色谱技术的精髓所在。 例如，通常用1090的甲醇/水，梯度洗脱30min，即可找出适宜的Cb浓度。 用高浓度Cb洗脱，可保证先将所有的峰都洗脱出来，不丢失组份，然后再调节Cb浓度，找到更好的分离效果，加大各组份色谱峰的分离度。 甲醇降低10，k可降低23倍。,
