1、 凯基生物科技发展有限公司 电话：025-52880812 52880811 传真：025-528808301细 胞 凋 亡 研 究 实 验 手 册目 录 1 凋亡分析策略与产品的选择指南.2 常用凋亡检测产品和方法2.1 凋亡形态学检测试剂盒系列（荧光/光学法）2.2 Annexin-V-FITC/EGFP检测试剂盒.2.3 TUNEL 凋亡原位检测试剂盒2.4 DNA LADDER 检测试剂盒.2.5 细胞 DNA含量检测试剂盒（细胞周期）.2.6 Caspase 活性检测试剂盒 .2.7 线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）2.8 端粒酶活性检测试剂盒.2.9. 凋亡与氧化应激检测.2.1
2、0 凋亡相关蛋白检测（蛋白定量、蛋白抽提、WB ECL.产品简介）2.11 凋亡相关基因检测（分子生物学产品产品简介）.附1：流式细胞仪和荧光显微镜的使用方法附 2：常用凋亡诱导剂附 3 不同荧光试剂检测波长表.附 4 凋亡相关试剂盒选择参考凯基生物科技发展有限公司 电话：025-52880812 52880811 传真：025-5288083021 凋亡分析策略与产品的选择指南凋亡分析总体原则：1）因为凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；所以需进行多指标同时检测；2)由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；而每个指征维持有一个时间段，所以需要在不同的时间点进行采样
3、，以保证检测结果的准确性；3）实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现假阳性或者假阴性。刚开始着手分析凋亡时，整体试验方案的设计至关重要，试验方案设计主要从以下几个方面考虑：一：总体方案设计研究目的 检测指标 凯基相关产品选择指南：1 Annexin V 流式细胞仪分析2 DNA 含量分析、等3 （有关凋亡不同时期发生的分子事件请参见附图 2）B：判断凋亡的时期或数量（定量分析）A： 判断细胞的死亡是凋亡？还是坏死？（定性分析）1 细胞形态学观察2 Annexin V 荧光显微镜分析3 TUNEL 法/ DNA Ladder 分析4 Caspase 3 活性分析C：判断凋亡信号通路：是内源线粒体通
4、路？还是外源死亡受体通路？或内质网通路？D：判断各通路具体的分子调控机制1 KGA-501/2，211-217 KGA-2202 KGA-101-1083 KGA-701-704/111-1134 1 MYC 通路（P53 ARF 等）2 NF kappa B 通路3 JNK 通路4 ARK 通路1 线粒体通路：JC-1 染色 Caspase 9 活性等2 死亡受体通路：Caspase 8 活性等3 内质网通路；Bap31 等C 各通路相关分子详见表 1）1 KGA-101-1082 KGA-511-5123 凋亡诱导剂、 KGA601-604 KGA-201-4。301-4，401-4，KG
5、A-101-108 211-217 111-1131 KGA601-604；KGA401-40442 KGA 301-3043 KGP 系列（蛋白抽提 蛋白定量试剂盒）4 KGP 系列（WB/免疫组化）PR-PCR 试剂盒等分子生物学系列KGP 系列（蛋白抽提、蛋白定量3 KGP 系列（WB）4 KGP 系列（免疫组化）凯基生物科技发展有限公司 电话：025-52880812 52880811 传真：025-528808303凯基生物科技发展有限公司 电话：025-52880812 52880811 传真：025-528808304二：按照凋亡发生的时间顺序检测附图 2 凋亡不同时期发生的分子
6、事件凯基相关产品：1 诱导凋亡：凯基凋亡诱导剂2 受体活化：凯基膜蛋白抽提试剂盒/WB 相关产品3 细胞色素 C 检测试剂盒4 线粒体膜电势降低： 线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）5 Caspas 的活性： Caspas 3 8 9 2 6 等化学发光法检测试剂盒6 细胞膜磷脂酰丝氨酸 PS 暴露：Annexin v FITC/EGFP 检测试剂盒7 形态学改变：凯基凋亡形态学检测试剂盒（光学或荧光用）8 DNA 片断化：TUNEL 和 DNA Ladder 检测试剂盒四 根椐实验材料类型选择检测方法和产品 （详见附录 5）实验材料类型 检测方法或产品1 细胞 ： Annexin v FIT
7、C/EGFP， Caspas，JC-1，TUNEL，DNA Ladder 等均可使用2 新鲜组织 Caspas，WB 等相关产品3 冷冻组织 Caspas ，TUNEL ，WB 等相关产品4 固定组织 石蜡切片： TUNEL 法，免疫组化法凯基生物科技发展有限公司 电话：025-52880812 52880811 传真：025-528808305三 按照凋亡发生的细胞位点及信号通路检测细胞位置 凋亡事件 凯基相关产品细胞膜 1 磷脂酰丝氨酸 PS 暴露2 膜上受体1 Annexin v FITC/EGFP 检测试剂盒2 凯基膜蛋白抽提试剂盒/WB/IP 等相关产品细胞质及细胞器 1 线粒体膜电
8、位2 Caspas 的活性3 细胞色素 C3 其它信号分子1 线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）2 Caspas 3 8 9 2 6 等化学发光法检测试剂盒3 无4 凯基全蛋白抽提试剂盒/WB/IP 等相关产品细胞核 DNA3-OH 端断裂暴露DNA 断裂成小片断形成TUNELDNA LadderDNA 含量（Cell cycle）检测试剂盒Hochest DAPI PI EB 等 DNA 染料附表 3： Caspase 的靶分子Caspase 的靶分子大约有 100 多个底物，根椐其作用可分为四大类，多种作用导致凋亡发生。靶分子的类别 靶分子（底物）mediators and regulat
9、ors of apoptosis,Bid，(DFF45/ICAD)，NDUFS1, Bcl-2 and Bcl-Xl, IAPsFLIPL, AKT, FAK and RIP. ROCK1 kinase, PAK2 (p21-activated kinase 2 and MEKK1).structural proteins, Fodrin gelsolin actin filamentnuclear laminsintermediate filament proteins (keratins 18and 19, vimentin)adherence junction proteins -cat
10、enin and plakoglobin -catenincellular DNA repair proteins, DNA- dependent protein kinase (DNA-PK), Rad51 and ATM proteinscell cycle-related proteins. Cdc27, Wee1, and two Cdk inhibitors, p21CIP1 and p27KIP1.48,49凯基生物科技发展有限公司 电话：025-52880812 52880811 传真：025-528808306表1 各主要信号通路上的重要信号分子附表4 Bcl-2家族 哺乳动物
11、 Bcl-2家族大约有 20 种蛋白，可大致分为三类，如下表所示： Bcl-2 Homology (BH) domains. Bcl-2 、Bcl-Xl, Bcl-w, A1 ，Mcl-1 Anti-apoptotic members,“multi-BH domain” (BH1, BH2 and BH3)Bax, Bak, Bok anti- to pro-apoptotiBH3-only Bid, Bad, Bim,等 8个或更多成员 pro-apoptotic信号通路 通路 外源或内源信号分子 膜受体 胞质内信号分子或效应分子 核受体或效应现象外源死亡受体信号通路1 TNF pathwa
12、y2 FAS pathway3 TRAIL pathway TNFCD95L(FasL/APO-1L)TRAILTNFR1/2CD95(DR2FAS/APO-1)TRAILR1/2(DR1 DR2 etc)TRADD TRAF IKKB IB.RIP MAP3K MKK7 JNK XIAPFADDCaspase 8/10 Caspase 3/7/6FlipNF-BJUN/FOS凋亡效应分子（-Caspase 的靶分子详见附表2）内源 通路1 线粒体通路Mitochondria pathway.2 内质网通路 ER stress pathway.生长因子缺失，Ca 2+流，紫彬醇等，紫外线 UV
13、 化疗药物P53oxidative stress, chemical toxicity,Ca2+ ionophoresinhibitors of glycosylation导致 Ca2+流释放其余与线粒体通路相同NONOBcl-2家族( 附表3) （线粒体膜电位变化）细胞色素C/Apaf+ Caspase 9 SMAC/DIABLO HtrA2/Omi IAP Caspase 3/7/6GSPT1/eRF3.AIF caspase-12GADD153/CHOP, ALG-2, VCP BAP31,凋亡（-Caspase 的靶分子详见附表 2）DNA 断裂不详凯基生物科技发展有限公司 电话：02
14、5-52880812 52880811 传真：025-528808307外源死亡受体信号通路凯基生物科技发展有限公司 电话：025-52880812 52880811 传真：025-528808308凯基生物科技发展有限公司 电话：025-52880812 52880811 传真：025-5288083092.1 凋亡形态学检测试剂盒系列（荧光/光学法）.一、 检测原理对细胞形态的观察是研究凋亡的最基本方法。细胞凋亡的形态学变化是多阶段的，起始阶段，染色质固缩、分离并沿核膜分布，细胞质亦发生固缩，但细胞膜依然完整未失去选择透性；在凋亡后期，核染色质断裂为大小不等的片断，与某些细胞器如线粒体一起
15、聚集，为反折的细胞膜所包围，以后逐渐分离，形成凋亡小体；最后，凋亡小体被周围具有吞噬能力的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、消化。二、特点操作简单，结果直观，经济三、技术要点常规染色（如苏木素等）方法，光学显微镜观察四、案例分析案例 1：以 DAPI 染液（KGA-215）考察 HeLa 细胞凋亡的过程细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；a 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体（见图 1）。案例 2：以活细胞/凋亡细胞/坏死细胞鉴别试剂盒（KGA-501、50
16、2）考察细胞凋亡过程Dye Reagent 1 只进入活细胞，正常的细胞核及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；Dye Reagent 2 只能进入死细胞，将死细胞以及凋亡晚期的细胞核染成橙色。因此通过在荧光显微镜下观察细胞显色和形态的不同，可以同时将正常细胞、坏死细胞、凋亡早期细胞和凋亡晚期细胞区分开来（见图 2）。图 2：活细胞/凋亡细胞/坏死细胞鉴别试剂盒（KGA-501、502）试验结果五、常见问题和解决方案常见问题 可能的原因 解决方案无法区分正常细胞和凋亡细胞 无凋亡细胞或凋亡细胞数量很少，诱导凋亡细胞的方法不正确。1、延长诱导细胞凋亡的时间。2、选择其他的方法诱导细胞凋亡。六、参考文献
17、1、Zhichao Zhang, Yuanyuan Yang, Danni Zhang, Yuanyuan Wang, Xuhong Qian, Fengyu Liu. Acenaphthol 1, 2-b pyrrole derivatives as new family of intercalators: Various DNA binding geometry and interesting antitumor capacity. Bioorganic 129:279-290.3、Ricote M, Garcia-Tunon I, Fraile B, Fernandez C, Aller
18、 P, Paniaqua R, Rovuela M. P38 MAPK protects against TNF-alpha-provoked apoptosis in LNCaP prostatic cancer cells. Apoptosis. 2006 Nov; 11(11): 1969-1975.4、陈曦林，宫念樵，董冲，陈知水，叶启发。MAPK 反义寡核苷酸诱导大鼠成纤维细胞凋亡的研究。中国现代医学杂志。2005，9，Vol 15 No.17，2573-2576.图 1：HeLa 细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化正常细胞 凋亡早期细胞 凋亡晚期细胞 坏死细胞 凯基生物科技发展有限
19、公司 电话：025-52880812 52880811 传真：025-52880830102.2 Annexin-V-FITC/EGFP检测试剂盒一、检测原理：磷脂酰丝氨酸（PS）是一种带负电荷的磷脂，在正常生理情况下它主要存在细胞膜的内面，只分布在细胞膜脂质双层的内侧；而在细胞凋亡早期，由于细胞膜失去对称性，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS ）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin-V 是一种分子量为 3536kD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与 Annexin-V 的结合来判断细胞凋亡的情况。（见图 1）因此 Annexin-V 被
20、作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将 Annexin-V 进行荧光素（EGFP、FITC ）标记，以标记了的Annexin-V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。与 FITC 的绿色荧光信号相比，EGFP 的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，。 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜。由于凋亡早期细胞仍保持膜的完整性，碘化丙啶（PI ）在凋亡早期就不能进入细胞内。但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将 Annexin V 与 PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时
21、期的细胞区分开来。图 1：Annexin-V 检测细胞早期凋亡的检测原理二、特点简便快速，染色时间短（仅 10 分钟可完成） ，检测数度快（半分钟即可完成一份样品的测量） ，整个操作过程仅需 30 分钟。 三、技术要点1 105 细胞加入 Binding Buffer 加入 Annexin-V-FITC/EGFP 和 Propidium Iodide2 室温、避光、在 1 hour 内，进行荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。3 流式细胞仪检测，激发波长 Ex=488 nm; 发射波长 Em=530 nm。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。四、案例分析P388 细胞经 H2O2 诱导凋亡后，按照说明书操作，结果如图：1、 激光共聚焦荧光显微镜照片：2、 流式细胞仪对照 给药组 诱导剂处理
