1、第三章 动物实验基本操作技能第一节 实验动物的种类实验动物（experimental animal）指通过科学方法培育、繁殖和饲养而成并供医学、生物学实验使用的动物。通过遗传学与微生物学的控制，培育出来的个体具有较好的遗传均一性以及对外来刺激的敏感性和实验重复性，这些动物属于高质量的实验动物。常用实验动物的种类及其特点如下：一、青蛙与蟾蜍两者均属于两栖纲，无尾目。是教学实验中常用的小动物。青蛙和蟾蜍的心脏具有明显的自律性，即使在离体情况下仍能保持较长时间的、有节奏地搏动，可用于机能学的实验；其坐骨神经-腓肠肌标本常用于观察各种刺激或药物对外周神经、横纹肌或神经-肌接头的作用；蛙舌与肠系膜能作为
2、观察炎症反应和微循环变化的标本；蛙的腹直肌可用于鉴定胆碱能神经药物的作用。此外，还能用于水肿和肾功能不全实验。二、小白鼠属于哺乳纲，啮齿目，鼠科。是医学、生物学实验中用途最广泛和最常用的动物。因其生长快，饲养消耗少，繁殖周期短，产仔多，温顺易捉，能复制出多种人类疾病的模型，适用于需大量动物的实验。如半数致死量或半数有效量的测定、药物的筛选、药物效价比较等。也适用于避孕药、抗肿瘤药、中枢神经系统、缺氧等方面的研究。三、大白鼠同属于哺乳纲，啮齿目，鼠科。牙齿锋利，性情较凶，当受惊、被挑逗或较强的刺激时容易发怒咬人。雄性大白鼠之间常发生殴斗和咬伤。大白鼠也具有小白鼠的其他优点。因为可复制出多种的病理
3、过程和疾病模型，对创伤的耐受性较强以及个体较小白鼠大，所以用途广泛。一些在小白鼠身上不便进行的实验可选用大白鼠进行研究，如水肿、炎症、休克、胃酸分泌、胃排空、高血压、心功能不全、脏器的缺血-再灌注损伤、黄疸、肾功能不全等。大白鼠的踝关节还用于观察药物抗炎作用等实验。四、豚鼠又名天竺鼠、荷兰猪。哺乳纲，啮齿目，豚鼠科。性情温顺。对组胺敏感并易于致敏，故常选用于复制变态反应性疾病的动物模型和研究抗过敏药如平喘药和抗组胺药的实验。豚鼠对结核菌敏感，故也常用于抗结核病药的治疗研究。此外，还用于钾代谢障碍、酸碱平衡紊乱的实验研究，豚鼠的心房和乳头肌可用于心肌电生理等实验。五、家兔属哺乳纲，啮齿目，兔科。
4、品种多，常用的有青紫蓝兔、中国本地兔(白家兔)、新西兰白兔和大耳白兔。青紫蓝兔体质强壮，适应性强，易于饲养，生长较快。中国本地兔(白家兔) 抵抗力较青紫蓝兔差。新西兰白兔是引进的大型优良品种，成熟兔体重在 45.5kg。大耳白兔耳朵较长较大、血管清晰、皮肤白色，但抵抗力较差。家兔性情温顺，个体较大，便于静脉注射、灌胃和取血。是机能学教学实验中最常用的动物。可用于影响呼吸、血压、尿生成和中枢神经系统功能的因素以及药物的实验研究；还可用于水肿、炎症、钾代谢障碍、酸碱平衡紊乱、缺氧、DIC、休克、心力衰竭等研究。由于兔体温变化较敏感，也常用于体温实验及致热原检测、发热的实验研究。六、猫与家兔相比，猫
5、的血压比较稳定，对手术创伤的耐受性较好，故常用于观察血压的实验。此外，猫也用于心血管药、镇咳药和中枢神经系统的药物的实验研究。七、狗哺乳纲，食肉目，犬科。对外环境适应力强。嗅觉灵敏，血液、循环、消化和神经系统均很发达，与人类较接近。狗易于驯养，经过训练能很好地配合实验；适用于多种急、慢性实验，是最常用的大动物。狗作为实验动物常用于胃肠蠕动及消化液的分泌、条件反射、高血压模型的制作及治疗、慢性毒理等慢性实验。此外，还可用于血压和呼吸的测量、酸碱平衡紊乱、DIC 、休克以及实验动物外科等实验。由于狗的价格较昂贵，在教学实验中不如一些中小动物常用。第二节 实验动物的品系关于实验动物品系的分类，尚待统
6、一明确；目前的分类命名有以下几种。一、按遗传学特征分类1近交系 指通过连续 20 代或以上全兄弟姊妹或亲子(子女与年青的父母)进行交配后进行培育而成的品系。近交系能消除动物种群的杂合性，因为经过 20代或以上近交培育后，动物个体之间有 98%的遗传位点是纯合的，个体间遗传差异很少。据此，近交系动物也称为“纯种” 。近交系动物的生育能力和生活能力都降低甚至衰退，对外界环境因素的变化也比较敏感，从而增加饲养和繁殖的难度。由于近交系动物遗传纯合性高、个体间遗传性状差异小、特征稳定等优点，在医学和生物学研究的用途广泛，如组织的移植以及肿瘤的研究等。某些近交系动物能自发或容易诱发某些疾病或肿瘤，成为相关
7、方面研究的动物模型。2. 突变品系 突变品系是在近交系动物的繁殖、培育过程中，由于下列原因而建立的动物品系：单个基因的突变、人为地将某个基因导入、采用特定的交配方式使个别位点的基因处于杂合状态。其中，某个位点上发生突变而培育出来的近交系亚系称为突变同源近交系；通过基因导入方法把一个特定基因植入近交系的基因组内培育出来的品系称为同源近交系；采用特定交配方式保持个别位点的基因处于杂合状态，这种方法培育出来的品系称为分离近交系。同一突变品系的个体间遗传特性极相似，表现出相同的遗传缺陷或病态，如侏儒、无毛等。目前已培育出多种的自然具有某些疾病的突变品系，例如肿瘤鼠、白血病鼠、贫血鼠、糖尿病鼠、高血压鼠
8、和裸鼠(无胸腺、无毛)等。这些品系的动物大量应用于相应疾病的发病机制和防治研究，具有重大的价值。3. 杂交一代 杂交一代又称为系统杂交性动物，指由两个近交系动物杂交生育的第一代后代。其遗传性状均等地决定于亲本品系，每个位点上的等位基因分别来自父系和母系。假如亲本品系间基因相同，杂交一代这个位点成为纯合基因，否则便是杂合基因。杂交一代会携带许多杂合基因，但是其个体间在遗传上是一致的。杂交一代能保持近交系动物的特点和杂交优势。近交系动物的适用范围同样适用于杂交一代，且有同样的实验效果。由于杂交一代具有杂合的遗传组成，同时能接受 2 个亲本品系的细胞、组织、器官以及肿瘤的移植，适用于免疫学等方面的研
9、究。4封闭群 又称远交群。是一个长时期与外界隔离，雌雄个体之间能够随机交配的动物群。1973 年日本实验动物研究会规定：5 年以上不从外部引种,只在一定的群体中进行繁殖，为经常提供实验动物而进行生产的群体叫做封闭群。封闭群动物具有杂合特性并避免了近交，避免了出现近交衰退现象，可以大量繁殖生产。目前已培育出的封闭群动物有：昆明种小鼠、LACA 小鼠、Wistar大鼠、NIH 小鼠、 青紫兰兔、新西兰兔等。中国昆明种小鼠，是目前使用最多的实验动物。封闭群个体间存在杂合性，故反应性具有差异；个体间的重复性和一致性不如近交系动物好。根据这些特点，封闭群动物一般适用于药物筛选、毒理实验和教学实验使用。5
10、. 非纯系 即一般任意交配繁殖的杂种动物。杂种动物具有旺盛的生命力，适应性强，繁殖率高，生长快，易于饲养管理。个体差异大，反应性不一致，实验结果的重复性差；包含有最敏感的与最不敏感的两种极端的个体，适用于筛选性实验。杂种动物较经济，在教学实验中最常用。6转基因动物（transgenic animal） 是指以实验方法导入外源DNA（包括同一物种DNA） ，在基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。1981年，人类第一次成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。次年获得转基因小鼠。此后相继成功地培育了转基因兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、牛、鸡、山羊、大鼠等转基因动物。根据不同的目的，转基因
11、动物可以简单地划分为四种类型：疾病型转基因动物； 利用转基因动物制药； 动物改良型；基础生物学研究。二、按微生物学特征分类根据对于微生物的控制狀況，一般分為四个等級：第一級是无菌动物、第二級为特定病原体动物、第三級即为无特定病原体动物、第四級为一般动物。1.无菌动物 无菌动物是指体表、体内各系统任何部位都检不出微生物、寄生虫的实验动物。这种动物是在无菌条件下剖腹产出，在无菌的、恒温、恒湿的条件下饲养，食品饮料等全部无菌，成本极为昂贵。2.特定病原体动物 是指附有特定而明确的微生物和寄生虫的动物，由前述无菌动物与原有的此种特定病原动物同居，或將特定菌种人为地给予无菌动物身上，生產成本亦甚昂貴。3
12、. 无特定病原体动物(Specific pathogen free animal, SPF 动物) 是指实验动物沒有附存特定微生物或寄生虫的动物。SPF 动物饲养於隔离系統中，允許常态微生物自然定着，动物带有已知的非病原微生物。以上三种动物统称为悉生动物。因其繁殖饲养条件复杂，价格昂贵，故不适用于教学。但对某些医学和生物研究具有重要意义。4. 带菌动物 这类动物可能带有多种微生物和寄生虫，甚至是致病的病原体。这类动物直接饲养于开放的环境中，其培育和饲养的成本低，常用于教学实验。第三节 实验动物的选择在医学研究中实验动物常作为人的替身，接受各种实验。选择实验动物的原则如下。一、 3R 原则 3R
13、 是指 Reduction（减少）、Replacement（替代）和 Refine-ment（优化）。它们分别指减少试验用的动物和实验的次数；尽可能用替代物代替实验动物，如用细胞组织培养方法等；对待实验动物和动物实验工作应做到尽善尽美。二、 从病原体的标准去选择实验动物 科研实验要选用三级或以上的实验动物。这些动物已经排除了人兽共患疾病，排除了实验动物本身的传染病以及影响实验研究的相应病原体；这样能使实验研究在没有或很少有外源性干扰的情况下进行，保障实验的顺利进行和获得可靠的数据。三、 从遗传学选择实验动物 科研实验应参照实验的要求分别选择使用近交系、突变系、封闭群、杂交系及转基因动物。如选择
14、近交系动物，应参照其遗传基因表达的表型。要求能在它们的行为、生理生化、寿命、疾病、解剖、药物反应、免疫、对病原体的感受性和生殖等方面表现出来。如 A 系与 BALB/c 两个品系的小鼠在存活期、自发肿瘤、药物反应和生殖上都有明显的差异。转基因动物可根据其具体用途而选择。例如，用转基因技术等方法去掉猪的合成 G 抗原的半乳糖苷转移酶基因可能克服器官移植排斥反应。以上 3 项原则对于医学科研实验尤为重要。四、从效果上来选择实验动物 实验效果与选用的动物种属、品系有密切关系。因此，应先决定使用哪种类型动物；其次，选择动物的品系类型，如是用近交系还是封闭群；最后，具体选择实验动物的品系。1种属的选择
15、动物的种系不同，实验效果也不相同。兔、鸡、鸽、猪、狗、猴等动物饲以高胆固醇饮食，都可以诱发动物的高脂血症或动脉粥样硬化，但发病情况各不相同。家兔主要表现为主动脉粥样硬化；而猴、猪除有主动脉粥样硬化外，心冠状动脉前降支也形成明显的斑块，可引起大片的心肌梗塞，情况与人较相似。尽管灵长类动物取得的实验结果最有说服力；然而医学实验往往先考虑容易获得且便宜的小型动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等。必要时再过渡至狗、猴等大型动物。不同的动物可用于目的不同的实验。例如，豚鼠易于致敏而成为过敏或变态反应研究的首选动物；家兔体温变化灵敏而常用于发热及其相关实验研究；大白鼠、家兔、狗常用于高血压的研究；小白鼠和大白
16、鼠常作为肿瘤研究的首选动物；家兔主动脉弓压力感受器的传入神经在颈部自成一束的减压神经，成为研究减压反射的首选动物；雄蛙常用作妊娠试验观察激素对排精的影响。2品系的选择 对同一致病刺激物，即使同一种系的不同品系动物，反应也不同。例如，津白 II 号小鼠容易致癌；津白 I 号小鼠就不易致癌。五、个体的选择同一品系的动物，对相同的刺激因素的反应会存在着个体差异，其原因与性别、年龄、生理状态和健康情况等有关。1. 性别 不同性别对同一致病因素的反应可不同。与雌性大鼠相比，采用雄性大鼠进行心脏缺血再灌注实验容易成功。即使对性别无特殊需要，实验设计的各组动物仍宜选用雌雄各半。若性别对实验结果没有影响，亦可
17、雌雄不拘。2. 年龄 一般而言，年幼动物较成年动物敏感。动物年龄可按体重来估计。大体上，成年小白鼠为 2030g；大白鼠为 180250g；豚鼠为 450700g；兔为2.22.5kg；猫为 1.52.5kg；狗为 915kg。急性实验首选成年动物；慢性实验最好选用年轻一些的动物。3. 生理及精神状态 妊娠、授乳等特殊生理状态使动物的反应性变化明显。精神因素对实验结果也有明显的影响。当动物遭遇恐吓、虐待、创伤、疼痛等情况下，交感-肾上腺髓质系统和下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统高度兴奋，从而明显影响循环系统、机体的代谢以及免疫功能，甚至引致应激性溃疡等应激性疾病。4. 健康性 动物处于衰弱、饥饿、
18、寒冷、疾病等情况下，实验结果可信性下降。因此，应该选用健康动物进行实验；可参照下列外部特征判断哺乳动物的健康状况。（1）一般状态：发育良好，眼睛有神，爱活动，反应灵活，食欲良好。（2）头部：眼结膜不充血，瞳孔明亮；眼和鼻无分泌物；呼吸均匀，无罗音，无鼻翼扇动和喷嚏。（3）皮毛：柔软、有光泽、清洁，无脱毛和蓬乱现象；皮肤无真菌感染。（4）腹部：不膨大，肛门区清洁无稀便或分泌物。（5）外生殖器：无损伤，无脓痂或分泌物。（6）爪趾：无溃疡和结痂。严格来说，动物健康的判断应包括微生物和寄生虫的检测、组织学的检测等。第四节 实验动物的编号、抓拿与固定一、实验动物的编号对实验动物编号是为了辨认。狗、兔等大
19、动物可用特制的金属号码牌固定于耳上。白色家兔和小动物可用黄色苦味酸溶液涂于身体特定部位的毛上标号。如编号110 将小白鼠背部分前肢、腰部、后肢的左、中、右部共九个区域。从右到左为 19 号，第 10 号不涂黄色(图 3-1)。图 3-1 小 白 鼠 背 部 的 编 号 图 3-2 小 鼠 的 捉 拿 及 固 定 法二 、 实 验 动 物 的 捉 拿 方 法1. 蛙和蟾蜍 用左手握持动物，以食指和中指夹住双侧前肢。捣毁脑和脊髓时，左手食指和中指夹持蛙或蟾蜍的头部，右手将探针经枕骨大孔向前刺入颅腔，左右摆动探针捣毁脑组织。然后退回探针向后刺入椎管内破坏脊髓。固定方法根据实验要求。2. 小鼠 右手提
20、起尾部，放在鼠笼盖或其他粗糙面上，向后上方轻拉；此时小鼠前肢紧紧抓住粗糙面，迅速用左手拇指和食指捏住小鼠颈背部皮肤并用小指和手掌尺侧夹持其尾根部固定手中（图 3-2） 。3. 大鼠 捉拿及固定方法基本同小鼠。捉拿时，右手抓住鼠尾，将大鼠放在粗糙面上。用厚布盖住大鼠，左手戴上防护手套；用左手抓住整个身体并用拇指和食指紧捏大鼠的下颌骨两侧，固定其头部以防咬伤。捉拿时勿用力过猛，勿捏其颈部，以免窒息。大鼠在惊恐或激怒时易将实验操作者咬伤，在捉拿时应注意(图 3-3)。4. 豚鼠 捉拿时以拇指和中指从豚鼠背部绕到腋下抓住豚鼠，另一只手托住其臀部。体重小者可用一只手捉拿，体重大者捉拿时宜用双手(图 3-
21、4)。5. 家兔 一手捏住其颈背部皮肤，将兔轻轻提起，另一手托住其臀部(图 3-5)。6. 猫 捉拿时先轻声呼唤，慢慢将手伸入猫笼中，轻抚猫的头、颈及背部，抓住其颈背部皮肤并以另一手抓其背部（图 3-6） 。如遇凶暴的猫，可用套网捉拿。猫的爪和牙齿锋利，勿被其抓伤或咬伤，必要时可用固定袋将猫固定。图 3-3 大 白 鼠 抓 拿 方 法 图 3-4 豚 鼠 抓 拿 取 方 法图 3-5 家 兔 抓 拿 方 法 图 3-6 猫 抓 拿 方 法三、实验动物的固定1狗的固定方法（1）狗的捆绑 抓狗时，二人需协作用特制的钳式长柄夹分别夹住狗颈部和腰部并将狗掀翻在地，按下述方法捆绑其嘴，以免咬人：用一根粗
22、绳兜住下颔，绕往上颔打一结（亦可不打结） ，然后将两绳端绕向下颔再作一结，最后将两绳端引至耳后，在颈项上打第三结，在该结上再打一活结(图 3-7)。捆绑后可对狗麻醉，尔后立即解绑。狗嘴被捆绑后，动物只能用鼻呼吸，若鼻腔有多量粘液填积，可能造成窒息。有些麻醉药可引起呕吐，尤应注意。（2）头部的固定 待狗处于麻醉状态，将其固定在手术台上。固定的姿势，依手术或实验内容而定，一般多采取仰卧位或俯卧位。前者便于颈、胸、腹、股等部的实验，后者便于脑和脊髓实验。铁制的狗头夹用于固定狗头并将狗固定于手术台上。（3）四肢的固定 四肢的固定一般在头部固定以后。若动物取仰卧位，可将两后肢分开，先用粗棉绳的一端绕成活
23、结（图 3-8）缚扎于踝关节的上方；再将另一端分别缚在手术台两侧的木钩上。固定前肢时，前肢须平直放在躯干两侧。按上述方法用粗棉绳分别钭绑缚左右前肢，再从狗背后交叉穿过，压住对侧前肢小腿，分别缚在手术台两侧的木钩上。图 3-7 捆 绑 狗 嘴 的 步 骤 图 3-8 绑 扎 动 物 四 肢 的 扣 结2猫和兔的固定方法（1）头部的固定 固定猫头和兔头可分别用特制的猫头夹和兔头夹。兔头夹为附有铁柄的半圆形铁圈和一可调铁圈。固定时，先将麻醉好的兔颈部放在半圆形的铁圈上，再把嘴伸入可调铁圈内，调节适当位置后旋紧螺丝，最后将兔头夹的铁柄固定在实验台上。固定兔头可用粗棉绳，一端栓在家兔的两只上门齿，另一端栓在实验台的铁柱上。以上方法较适于仰卧位固定。（2）四肢的固定 猫和兔取仰卧位时，方法与上述狗仰卧位四肢固定方法相同；若动物取俯卧位，前肢缚绳即不必左右交叉，将四肢缚绳直接固定在实验台两侧前后固定钩上即可。现在的兔手术台两边常有可调的螺旋夹，使用方便。应用时要夹在家兔四肢的适当部位，减轻动物的疼痛。
