1、ELISAELISA 技术的-操作要点ELISA 技术的-操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式 ELISA 各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球 ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。4.1 标本的采取和保存 可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，体液（如血清） 、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿
2、液） ，有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物） 。大部分 ELISA 检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA 中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，
3、在间接法 ELISA 中可使本底加深。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于 4，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见 3.2.4） 。4.2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用 pH 计测量较
4、正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。4.3 加样 在 ELISA 中一般有 3 次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在 LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法 ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡 1 分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液
5、时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。4.4 保温 在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在 ELISA 中似不恰当。ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么 ELISA 反应总是需要一
6、定时间的温育。温育常采用的温度有 43、37、室温和 4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在 37经 1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在 43进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应 4更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在 ELISA 中一般不予采用。保温的方式除有的 ELISA 仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将 ELISA 板置于水浴箱中，ELISA 板底应贴着水面，使温度
7、迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA 板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将 ELISA 板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指 20-25，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA 板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个
8、人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。4.5 洗涤 洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在 ELISA 操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。洗涤的方式除某些 ELISA 仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过程如下：
9、（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去） ；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置 1-2 分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作 c和 d，洗涤 3-4 次（或按说明规定） 。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结
10、合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温 20，其浓度可在 0.05%-0.2%之间，高于 0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。（2）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗 2 分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡 2 分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水
11、压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 4.6 显色和比色 4.6.1 显色 显色是 ELISA 中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。OPD 底物显色一般在室外温或 37反应 20-30 分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD 底物液受光照
12、会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD 产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。TMB 受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB 经 HRP 作用后，约 40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至 2小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。4.6.2 比
13、色 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准 96 孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔） ，以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD） ，现按规定用吸光度（absorbence，A） ，两者含义相同。通常的表
14、示方法是，将吸收波长写于 A 字母的右下角，如 OPD 的吸收波长为492nm，表示方法为“A492nm“或“OD492nm“。4.6.3 酶标比色仪 酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读 ELISA 结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到 0.001，准确性为1%，重复性达 0.5%。举例说，若某孔测得的 A 值为 1.083，则该孔相对于空气的真实 A 值应为 1.0830.01(1.0731.093）
15、，重复测定数次，其 A 值均应1.0830.05（1.0781.088）在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在 0.0002.000，新型号的酶标仪上限拓宽达 2.900，甚至更高。超出可测上限的 A 值常以“*“或“over“或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为 0.0002.900，而其线性范围仅 0.0002.000，这在定量 ELISA 中制作标准曲线时应予注意。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在 1530，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定。测读 A 值时，要选用产物的敏
16、感吸收峰，如 OPD 用 492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1） ，第二次在不敏感波长（W2） ，两次测定间不移动ELISA 板的位置。例如 OPD 用 492nm 为 W1，630nm 为 W2，最终测得的 A 值为两者之差（W1-W2） 。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书。4.7 结果判断 4.7.1 定性测定 定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有“或“无“的简单回答，分别用“阳性“、“阴性“表示。“阳性“表示该标本在该测定系统中有反应。“阴
17、性“则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法 ELSIA 中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法 ELISA 中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。（1） 间接法和夹心法 这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在 ELSIA 中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底
18、，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物（见 3.6） 。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本（sample，S） 、阳性对照（P） 、和阴性对照（N）的吸光值，然后进行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。a 阳性判定值 阳性判定值（cut-off value）一般为阴性对照 A 值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。用此法判断结果要
19、求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测 HBsAg 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含 HBsAg 的复钙人血浆，阳性对照品 HBsAg 的含量标明为 P=92ng/ml。每次试验设 2 个阳性对照和 3 个阴性对照。测得 A 值后，先计算阴性对照 A 值的平均数（NCX）和阳性对照 A 值的平均数（PCX） ，两个平均数的差（P-N）必须大于一个特定的数值（例 0.400） ，试验才有效。3 个阴性对照 A 值均应0.5NCX
20、，并1.5NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算 NCX；如有两个阴性对照 A 值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：阳性判定值=NCX+0.05标本 A 值阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中 0.05 为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生“试验无效“的后果。b.标本/阴性对照比值 在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S）和阴性对照（N）的 A 值后，计算 S
21、/N 值。也有写作 P/N 的，这里的 P 不代表阳性(positive)，而是病人（patient）的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用 S/N 表示。在早期的间接法 ELISA 中，有些作者定出 S/N 为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N 的阈值。更应注意的是，N 所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如 N0.05（或其他数值） ，则按 0.05 计算，否则将出现假阳性结果。（2）竞争法 在竞争法 ELISA 中
22、，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在 1.0-1.5 之间，此时反应最为敏感。 竞争法 ELISA 不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出 S、P 和 N 的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。a. 阳性判定值法 与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照 A 值，现举某种检测抗 HBc 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗 HBc 的复钙人血浆，阳性对照中抗 HBc 含量为125100u/ml。每次试验设 2 个阳性
23、对照和 3 个阴性对照。测得 A 值后，先计算阴性对照 A 值的平均值（NCX）和阳性对照 A 值的平均数（PCX） ，两个平均数的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例如 0.300）,试验才有效。3 个阴性对照 A 值均应小于 2.000，而且应0.5NCX 并1.5NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另 2 个阴性对照重新计算NCX；如有 2 个阴性对照 A 超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：阴性判定值=0.4NCX+0.6PCX标本 A 值阳性判定值的反应为阳性，A阳性判定值的反应为阴性。b. 抑制率法 抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按
24、下式计算：抑制率（%）= （阴性对照 A 值-标本 A 值）100%/阴性对照 A 值一般规定抑制率50%为阳性，50%为阴性。4.7.2 定量测定 ELSIA 操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法 ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近 2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈 S 形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。甲胎蛋白质
25、ELISA 测定的标准曲线示例见图 4-1。 测定小分子量物质常用竞争法（参见 2.2） ，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA 测定的标准曲线示例见图 4-2。注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达生物谷讲座 2：ELISA 技术中的抗原与抗体的反应抗体 1.2.1 抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig 分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE。与免疫测定有关的 Ig 主要为 IgG 和 IgM。Ig 由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig
26、 的轻链是相同的，有 （kappa）和 （Lambda）两种型别。五类 Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG 和 IgM 的重链分别称为 （gamma）链和（mu）链。IgG 的结构见图。 木瓜酶裂解部位 胃蛋白酶裂解部位 重链和轻链的 N 端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用 VH 和 VL 表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图） ，是抗体专一性结合抗原的结构基础。 IgG 可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab） 。每个 Fab 都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价
27、的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称 Fc 段，无抗体活性，但具有 IgG 特有的抗原性。IgG 可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个 Fab 双体，称 F（ab）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似 Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。IgM 是由五个单体组成的五聚体，含 10 个重链和 10 个轻链，具有 10 个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM 分子量约为 900000，IgG 分子量约为 150000。机体被微生物感染后，先产生 IgM 抗体，然后产生 IgG 抗体。经过一段时间，IgM 抗体量逐渐减少而消失，而 IgG 抗体可长期存在，在疾
28、病痊愈后可持续数年之久。IgM 抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此 IgM 抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。右图为为甲型肝炎病人血清中 IgG 抗体和 IgM 抗体出现的时间和水平。1.3 抗原抗体反应1.3.1 可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAb抗体的亲和力（affinity）是抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数 K 表示：K=AgAbAgAbAgAb 的解离程度与 K 值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因
29、此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。在抗血清中，特异性的 IgG 抗体仅占总 IgG 中的极小部分。用亲和层析法提取的特异性抗体，称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可得到更好的效果。1.3.2 最适比例在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图 1-4。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带（zone of equivalence） 。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象（zone phenomenon） 。抗体过量称为前带（prezone） ，抗原地过量称为后带（postzone） 。在用免
30、疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。1.3.3 特异性抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg） 、e 抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg） ，随来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原
31、抗体反应中可出现交叉反应。例如：绒毛膜促性腺激素（hCG）和黄体生成激素（LH）均由 和 两个亚单位组成，其结构的不同处在 亚单位，而两者的 亚单位是同类的。用 hCG 免疫动物所得的抗血清中含有抗 -hCG 和抗 -hCG 两种抗体，抗 -hCG 抗体将与 LH 中的 酶位发生交叉反应。在临床检验中，如用抗 hCG 抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中 hCG，只能用于 hCG 浓度较高的试验，否则妇女生理性排泄入尿液中的微量 LH 将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断（敏感度应达到 50mIu/mlhCG）的实际中必须应用只对 hCG 特异的抗 -hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。1
32、.3.4 敏感性在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为 mg/ml 水平，酶反应测定法的敏感度约为510g/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍，达 ng/ml 水平。例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定 HBsAg，其敏感度可达 0.1ng/ml。1.4 免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广，在临床检验中可用于测定：1) 体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。2) 激素
33、，包括小分子量的甾体激素等。3) 抗生素和药物。4) 病原体抗原，HBsAg、HBeAg 等。5) 另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs 等。5 标记的免疫测定如上所述，免疫测定是一种很敏感的测定方法，抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度，敏感度可达 510g/ml，但在临床检验中，某些待测物在标本中的含量远低于这一水平，因此要寻找增加敏感度的方法。标记的免疫测定是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记，通过测定标记物来提高敏感度。在放射免疫测定和酶免疫测定中，标记物分别为放射性核素和酶，最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量，敏感度可比直接测定沉淀物提高数
34、百至数千倍。在标记免疫测定中，一般加入过量的标记试剂以保证与待测物彻底反应。以标记抗体（Ab）检测抗原（Ag）为例，反应式如下：Ag+ Ab AgAb+ Ab 在反应产物中有与 Ag 结合的 Ab和游离和 Ab，如不将两者分离而测定标记物，测得的结果将为两者之和。因此，游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤。可采用多种手段，固相载体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上，然后再与标记的抗原或抗体直接反应，结合的标记物被固定在载体上，而游离的标记物留于溶液中。这样可以通过洗涤将游离的 Ab除去，结合标记物的测定可在固相上进行。6 酶免疫测定酶免疫测定（enzyme immun
35、oassay）可分为均相（homogenous）和非均相（heterogenous）两种类型。在均相 EIA 中可不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。例如在某种条件下，抗原抗体反应后形成的酶标记抗原抗体复合物中的酶失去其对底物作用的活力，因而测出的酶活力直接反映游离的酶标记物。均相 EIA 在临床检验中较少应用。非均相 EIA 需先进行游离的和结合的标记物的分离。如前所述，固相载体可用作一种分离手段。这种固相酶免疫测定方法在 1971 年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay） ，简称 ELISA，在国内有译作酶联免
36、疫吸附试验的，虽然含义不完全确切，但已习用生物谷技术讲座：ELISA 原理与分类1. ELISA 的原理ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。2. ELISA 的类型ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的
