1、细菌内毒素检查,王文洁,一、试剂及仪器,注射用头孢他啶鲎试剂（标示灵敏度），细菌内毒素标准品，细菌内毒素检查用水（BET水），仪器（严格消毒）,质量标准：中国药典（2005年版）第二部 p135细菌内毒素检查法：附录,二、实训内容,1.细菌内毒素标准溶液的制备,150151.0 0.5 0.25 0.125,0.21.8BET,0.22.8BET,0.90.9BET,0.90.9BET,0.90.9BET,2 0.5 0.25,供试品的最大有效稀释倍数（MVD）MVDCLC - 为供试品的浓度（当L以EU/ml表示时，C取1.0ml/ml） L - 为供试品的细菌内毒素限值，EUml - 鲎试
2、剂的标示灵敏度（EU/ml）,2.供试品溶液的制备,PC阳性对照2内毒素溶液PPC供试品阳性对照含2内毒素溶液的供试品NC阴性对照BET水,3.对照,4.检查,SPCPPCNC 各两支,将安瓿瓶中溶液轻轻混匀后，封口膜封口，垂直放入371水浴中，保温602分钟。,细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。,美国药典近800种药物要用细菌内毒素检查法来做为质量控制手段。我国药典至2005年版正式收载了需“细菌内毒素检查法”品种达234种。,细菌内毒素检查鲎试剂
3、法,2005版中国药典二部收载的细菌内毒素检查法部分品种表,2005版中国药典三部收载的细菌内毒素检查法部分品种表,鲎试剂法优点,快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品。鲎试剂法局限性对革兰阴性杆菌以外的内毒素不够灵敏。,（鲎变形细胞溶解物）,凝固酶,内毒素、Ca2+,原理,活化的B因子,LAL中的B因子,凝固酶原,凝固原(可凝性蛋白),凝固蛋白（凝固素),凝胶,细菌内毒素检查可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除有专门说明外，以凝胶法结果为准。,细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法光度测定法:包括浊度法和显色基质法,概述,1.抗生素（antibiotics）
4、在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称,3.来源,生物合成（发酵） 化学合成或半合成,4.特点,化学纯度较低 活性组分易发生变异 稳定性差,5.抗生素质量分析生物学法、物理化学法,鉴别：理化方法、微生物法 检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等 含量/效价测定： 微生物法 ： 与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大 理化方法：准确度与专属性较高, 且操作简便；但与临床疗效有偏差,内酰胺类,氨苄西林,阿莫西林,青霉素（苄青霉素）（penicillins）,头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,氢化
5、噻唑环,氢化噻嗪环,母核：6氨基青霉烷酸,母核：7氨基头孢菌烷酸,结构与性质,1.酸性（羧基） pKa 2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。,2.手性C （旋光性）,3.UV,青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构,260nm,4. 内酰胺环(四元环张力+酰胺键 ),干燥条件较稳定，溶液不稳定,某些氧化剂、金属离子、温度,Identification,(三)呈色反应,1）羟肟酸铁反应内酰胺环,2）茚三酮反应-氨基,(红、棕、褐),3）双缩脲反应内酰胺类,4）变色酸-硫酸反应,5）重氮苯磺酸反应酚羟基,（偶合）,6）铜盐反应头孢氨苄的专属反应,7）硫酸-甲醛反应
6、(BP),青霉素钾和青霉素钠呈红棕色,(四)焰色反应K+、Na+,Purity Test(聚合物、有关物质、异构体等),头孢他啶中聚合物测定,萄聚糖凝胶立体网状结构图,原理“分子筛”,氨基糖苷类,氨基环醇+氨基糖苷,链霉素(Streptomycin),巴龙霉素(paromomycin),D-葡萄糖胺脱氧链霉胺,巴龙胺,D核糖巴龙霉糖,巴龙二糖胺,庆大霉素(gentamycin),绛红糖胺,(紫素胺),2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺),Identification,坂口反应,麦芽酚反应,N-甲基葡萄糖胺反应,N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）,红
7、色,乙酰丙酮,OH-,麦芽酚反应链霉糖特有反应,H+,坂口反应链霉胍特有反应,四环素类,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,结构与性质,1）两性： -OH酸性 N(CH3)2碱性,Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；Fe3+形成红色配合物； Al3+形成黄色配合物 ；pH3 7.5 多价阳离子与酚二酮荧光,与酸、碱均可成盐； 临床多用盐酸盐； 强酸或强碱中溶解度,2）旋光性3）UV和荧光 4）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基),弱酸性（pH2-6） A环C-4异构化 差向四环素酸性（pH 2） C环脱水 脱水四环素 碱性 C环开环，形成内酯 异四环素,5）不稳定性,A.差向异构化,蓝色荧光,淡黄黑,（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）,B.酸性脱水降解,max = 445nm,max = 435nm,C.碱性脱水降解,OH-,技能：掌握采用鲎试剂法凝胶法进行细菌内毒素检查操作方法掌握根据观察阳、阴性结果判断细菌内毒素检查是否合格的方法相关理论：掌握鲎试剂法检查细菌内毒素的原理掌握细菌内毒素检查的意义熟悉抗生素类药物主要类别及性质,
