姜黄素对泡沫细胞形成的影响及机制.DOC
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1、作者简介 :刘承,男,硕士研究生,研究方向:动脉 粥样硬化的发病机制与防治 。 E-mail: 。 手机号码:15228284395。 通 信 作者:钟毅,男,硕士,主治医师,研究方向:动脉粥样硬化的发病机制与防治 。 E-mail:。 手机号码: 18283097928。 基金项目 :国家自然科学基金资助项目( 31300946);泸州市 -泸州医学院合作科技项目( 2013LZLY-J53)。 姜黄素 对 泡沫细胞形成的 影响及机制 刘承,李家富, 冯健, 钟毅 (泸州医学院 附属医院心内科 ,四川 泸州 646000) 摘要:目的 研究 姜黄素对氧化型低密度脂蛋白 ( oxidized
2、low density lipoprotein,ox-LDL) 诱导的人单核巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响 及 其可能的机制 。 方法 采用体外培养的 人单核细胞白血病细胞 ( human acute monocytic leukemia cell line,THP-1) 作为研究对象,由 佛波酯( Phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA) 刺激 人单核细胞为巨噬细胞,再加 入ox-LDL( 50 gmL-1) 诱导复制 形成 泡沫细胞模型。 实验分为空白对照组,模型组,姜黄素组, Toll样受体 ( Toll-like receptor,TLR) 4 抗体
3、组,姜黄素 + TLR4抗体 组, TLR4 同源非特异性抗体组。采用 油红 O 染色观察细胞形态; 实时荧光定 量 PCR和蛋白印迹法检测 TLR4 的表达;酶法测定细胞内总胆固醇 ( total cholesterol, TC) 、 游离胆固醇( free cholesterol, FC)、 胆固醇酯( cholesterol ester,CE)和甘油三酯( triglyceride, TG) 。 结果 与空白对照组 比较 ,模型组 TLR4 mRNA和蛋白 表达显著增加 (P 0.05),而姜黄素组 的表达明显降低 (P 0.05), 同时ox-LDL刺激 使 巨噬细胞胞内红染颗粒 显著
4、 增多, 且 细胞大量聚集;与模型组 比较 : 姜黄素组, TLR4 抗体组,姜黄素 + TLR4 抗体组胞内红染颗粒显著减少,细胞的聚集减轻,明显降低胞内 TC、 FC、 CE和 TG 的含量 (P 0.05);而 TLR4同源非特异性抗体组 却没有显著差别 (P 0.05)。 结论 姜黄素通过 抑制 TLR4 表达, 降低 胞内脂质的含量, 减少 人单核 巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。 关键字: 姜黄素 ;Toll样受体 4;氧化型低密度脂蛋白 ;泡沫细胞 Effect and Related Mechanism of Curcumin on the Formation of Foam Ce
5、lls Cheng Liu, Jiafu Li,Jian Feng, Yi Zhong(Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou,Sichuan 646000,China) ABSTRACT: Objective To explore the effect of Curcumin on the formation of foam cells induced by the Oxidized low density lipoprotein(ox-LDL) and analyze t
6、he related possible mechanisms. Method As the research object, THP-1 was incubated with PMA(160 nmolL-1) to differentiate into macrophages, then the macrophages were added with ox-LDL(50 ugmL-1) to induce the formation of replication foam cell model. Six experimental groups were included, they were
7、blank control group, model group, curcumin group, TLR4 antibody group, curcumin +TLR4 antibody group and TLR4 isotype control antibody group. The cell morphology was examined by Oil red staining. The expression of TLR4 was assessed buy Western Blot and Real-Time qPCR. Intracellular contents of TC, F
8、C, CE and TG were detected through enzymatic assays. Results Compared with the blank control, the expression of TLR4 significantly increased with ox-LD added(P 0.05), but the expression decreased with curcumin added(P 0.05). Additionally, intracellular red particles of macrophages and cell clusters
9、also increased with ox-LDL added;In comparison with model group, cells from curcumin group, TLR4 antibody group and curcumin +TLR4 antibody group aggregated less, and intracellular red particles decreased sharply as well as the content of TC, FC, CE and TG(P 0.05), however there was no obvious diffe
10、rence between model group and TLR4 isotype control antibodies group(P 0.05). Conclusion curcumin inhibits cholesterol accumulation in macrophages and the formation of foam cells by regulating the expression of TLR4. KEY WORDS: Curcumin; Toll like receptor 4; oxidized low density lipoprotein; foam ce
11、lls 动脉粥样硬化 ( atherosclerosis, AS) 通常被认为是冠心病最主要的原因,其 发生发展与炎症反应 、 细胞增殖和脂质积累等 紧密 相关 1。大量研究证实 2-4,脂质在巨噬细 胞中集聚形成泡沫细胞的过程是 AS 发生发展的重要环节和典型病理特征,该过程的主要特征是细胞外修饰性低密度脂蛋白( low density lipoprotein, LDL)的摄入和细胞内胆固醇流出之间的失衡 。因此抑制脂质的积累,增加胆固醇的逆转运,减少泡沫细胞的形成, 延缓 粥样斑块的进展,可能成为防治 AS 的突破点。 TLRs 是一类单个跨膜非催化性蛋白, 广泛存在于血管内皮细胞、巨噬细
12、胞表面,是感应病原体和传递细胞外抗体识别信息到胞内的首个受体,参与启动细胞内信号转导 以及 激活内含子、编码协同刺激分子等多种基因 5, 能识别病原体相关分子模式 (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)、损伤相关分子模式( damage-associated molecular pattern, DAMPs) 和 内源性配体,是参与天然免疫和特异性免疫的重要受体 6。 研究 证实 3, TLR4 作为巨噬细胞表面的模式识别受体 (pattern recognition receptor, PRR),在 AS 发生发展中发挥重要作用 。 Z
13、 Lu等 7发 现 TLR4 高度表达 于 人和小鼠富含脂质的动脉粥样斑块中,而在 TLR4 基因缺陷小鼠体内,动脉粥样斑块中的脂质 含量 则明显降低 ; Bjorkbacka 等 8发现在髓样分化因子 (myeloid differentiation factor88, MyD88)缺陷的小鼠体内巨噬细胞集聚和动脉硬化病变 有所 减轻,不久后 Saxena.5等也 报道 ,在 TLR2 和 TLR4基因缺陷小鼠体内粥样硬化斑块面积减少约 50%, 并且 TLR2 和 TLR4 在粥样斑块中的表达伴随 着 p65 核因子 B (nuclear factor-kappa B,NF-B)在病变内皮
14、细胞和巨噬细胞中的核转位。 另 外 , 作为 TLR4 的内源性配体, 修饰性低密度脂蛋白分子,如 ox-LDL 和轻度修饰低密度脂蛋白( minimally modified LDL, mmLDL)都是促进 AS 的修饰性自身抗原, 最近, Janeesh 等 9的实验表明 ox-LDL 可 激活TLR4,向细胞内传递信号并激活核转录因子 NF-B进一步诱导靶基因表达,触发 单核细胞趋化蛋白 -1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、肿瘤坏死因子 ( tumor necrosis factor, TNF-)、白细胞介素 6( interleukin,
15、IL-6)、血管细胞黏 附分子 1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)等释放, 触发炎症反应和泡沫细胞的形成。由于 TLRs 参与的泡沫细胞分化和形成的分子机制错综复杂,目前还未被完全阐明。 姜黄素是植物姜黄中最主要的活性物质, 具有抗炎、抗氧化、抗凝、抗血小板聚集以及调酯、降血压、保护血管内皮等作用 10。而 AS 是与炎症 反应 , 氧化应激、 血脂异常等紧密相关的疾 病,大量研究都已证实姜黄素有抗 AS 的作用10-12,尤其是在胆固醇平衡调节方面 13。研究 表明 1:姜黄素 通过依靠 泛素蛋白酶体系统( ubiquitin-protea
16、some system, UPS)降解清道夫受体 A(scavenger receptor A,SR-A)蛋白, 抑制 脂质的摄入, 同时 又通过 调控 过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)/肝 X 受体 ( liver X receptor ,LXR ),增加 ATP 结合盒转运蛋白 A1、 G1(ATP-binding cassette transporterA1、 G1,ABCA1、 G1)以及 SR-BI 的转录和翻译,促进胆固醇的流出。另外, 最近 Meng 等 11发现 姜黄素能通过抑制 T
17、LR4 介导的 NF-B/丝裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase,MAPK) 信号通路,减轻由脂多糖( lipopolysaccharide, LPS)诱导的炎症反应、氧化应激。 因此,本实验拟以人单核细胞源性巨噬细胞作为研究的对象,观察姜黄素对ox-LDL 诱导 的 泡沫细胞形成的影响,并对其机制做进一步探讨。 1 材料与方法 1.1 细胞株 THP-1, 美国菌种保藏中心( American Type Culture Collection,ATCC) 。 1.2 药物 与试剂 姜黄素、 PMA、油红 O 均为 美国 Sigma 公司 产品 ,
18、批号分别为: 78246、 P1585、 FS002030; RPMI-1640 培养基 , 美国 Gibco 公司 ,批号:11875093; 胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS), 美国 Hyclone 公司 ,批号:sv30087.02;人 ox-LDL, 广州奕源生物科技有限公司 ,批号: YB-002;细胞计数试剂盒( Cell Counting Kit-8, CCK-8) , 日本 DOJINDO 公司 ,批号: CK-04;苏木素 染色液,北京赛驰公司,批号: 070007-H3;多聚甲醛 、 RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测试试剂盒、 SDS-PAGE
19、 凝胶制备试剂盒、脱脂奶粉、 TBS 均为武汉阿斯本公司 产品 ,批号 分别为 : AS1018 、 AS1004、 AS1086、 AS1012、 AS1033、AS1024; TLR4 抗体、 TLR4 同源非特异性抗体、 甘油醛 -3-磷酸脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 抗体 均 为 英国 Abcam 公司产品 ,批号分别为: ab13867、 ab37416、 ab37168; 辣根过氧化物酶( horseradishperioxidase, HRP)标记的羊抗鼠二抗 , 美国 KPL 公司,批号:074-15
20、06; 0.45m PVDF 膜,美国 Millipore 公司 ,批号: IPVH00010; Trizol 试剂盒 , 美国 Invitrogen 公司 ,批号: 15596-026; 实时计量 PCR 逆转录试剂盒 , 日本 TOYOBO 公司 ,批号: FSK-100; 实时计量 PCR 测定试剂盒 SYBR Premix Ex Taq, 日本 TaKaRa 公司 ,批号: RR420A, TC、 TG 测定试剂盒 均为 南京建成生物工程研究所 产品 , 批号分别为: A111-1、 A110-1, 其余试剂均为国产或进口分析纯。 1.3 仪器 Cytomat 10 C 细胞培养箱 、
21、 TSE400D 超低温冰箱、 Multiskan GO 全波长 酶标仪、 Multifuge X3 台式超速离心机、 Micro CL 冷冻离心机、 9700PCR 仪均为 美国 Thermo Fisher 公司 产品 ; HH-4 型 恒温水浴锅,江南仪器厂; sw-cj-2f 型超净工作台,苏州净化公司; 倒置生物显微镜 、 TS100-F 倒置显微镜均为 日本Nikon 公司 产品 ; DYCP-36 型 电泳仪,北京六一仪器厂。 1.4 THP-1 细胞的培养 和 泡沫细胞模型 复制 将含有 10%FBS、 1%青链霉素的RPMI 1640 培养 液作为 THP-1 细胞完全培养基
22、, 细胞在 37 , 5%CO2 培养箱 中培养 ,每 2d 换液 一 次 , 45d 即可传代。 如文献所述 14, 取 处于 对数生长期细胞,用 含 160 nmolL-1PMA 的完全培养基诱导培养 48h,得到 THP-1 源性巨噬细胞。将所得细胞更换成含 50 gmL-1 的 ox-LDL 无血清 RPMI 1640 培养液, 培养箱中共同孵育 48h, 胞内 CE/TC50%即可认为 泡 沫 细胞模型 复制成功 15。 1.5 细胞活性检测 将对数生长期 THP-1 细胞与含 160 nmolL-1 PMA 的完全培养基配制成浓度为 每毫升 1105 个 的细胞悬液,按 每孔 10
23、4 个 细胞接种于 96 孔板,置于培养箱中培养 48h后 贴壁,按 CCK-8 试剂盒说明 书 操作,加入不同浓度 ( 080 molL-1) 姜黄素处理 24h 后, 用 酶标仪测定 490 nm波长下的光吸收值 作为判定细胞活性的指标 。 1.6 油红 O 染色和泡沫细胞形成率测定 用预先置入 无菌 盖玻片的 6 孔培养板培养细胞,按照不同分组处理细胞后,用 PBS 冲洗盖玻片 3 次,每次 5min, 4%多聚甲醛固定 30min,油红 O 染色 10min,苏木素复染 5min,分色返蓝后甘油封片。显微镜下观察, 按文献所述 16: 胞内较大红染颗粒 5个即可判定为泡沫细胞,镜下随机
24、观察 10 个视野,计算泡沫细胞数和细胞总数,泡沫细胞形成率 =泡沫细胞数 /细胞总数 100%。 1.7 蛋白质免疫印迹法( Western Blot) 离心收集细胞,加入 RIPA 裂解液提取总蛋白,使用 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白,每孔上样量 40g,按浓缩胶 80V、分离胶 120V 进行恒压电泳,切去相应胶带 300mA 恒流转印至 PVDF 膜;置于 5%脱脂牛奶室温封闭 1h,除去封闭液后加入 TLR4( 1 500)或内参照 GAPDH 一抗( 1 10000) 4 过夜,TBST 洗膜 3 次,每次 10min;加入 H
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