1、项目四 用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸,目录,L-酪氨酸L-酪氨酸的酶法合成弗氏柠檬酸菌的培养及破碎酪氨酸裂解酶的活力测定用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸,L-酪氨酸,L-酪氨酸属氨基酸的一种，结晶性粉末，无味，易溶于甲酸，难溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀盐酸胡哦哦稀硝酸中溶解。从酪蛋白或玉米等含蛋白质物质的水解液中提取，是人体非必需氨基酸。医药上用作治疗甲状腺功能亢进，也可做为食品添加剂。中文名称:L-酪氨酸 中文别名:L-对羟苯基-丙氨酸;(2S,3R)-2-氨基-3-对羟苯基丙酸 英文名称:L-Tyrosine 分子式:C9H11NO3 分子量:181.19,制备或来源：1.由含蛋白质
2、的物质（废丝、酪蛋白和玉米等）水解液中提取； 2.以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的l-酪氨酸生产菌发酵而得； 3.以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用-酪氨酸酶催化制取。 用途：1.医药用作甲状腺功能亢进； 2.食品添加剂。 3.是一种重要的生化试剂，是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料。 4.广泛用于农业科学研究，也作饮料添加剂和配制人工昆虫饲料。,L-酪氨酸对皮肤的作用皮肤白不白，主要取决于黑色素细胞合成黑色素的能力。在人的表皮基层细胞间，分布着黑色素细胞，它含有的酪氨酶可以将酪氨酸氧化成多糖，中间再经过一系列的代谢过程，最后便可生成黑色素。黑色素生成得多，皮肤就越黑；反之，则皮
3、肤就越白皙。 研究证明，酪氨酸酶的活性与体内的铜、铁、锌等元素密切相关。经常进食富含酪氨酸和稀有元素锌、铜、铁的物质，例如动物内脏、肾，甲壳类动物蛤、蟹、河螺、牡蛎，水产品乌鱼子，豆类的大豆、扁豆、青豆、赤豆，硬壳果类花生、核桃、黑芝麻以及葡萄干等，皮肤的色泽就较黑。因此住在海边的人，打渔的渔民，由于吃以上水产品较多，因此皮肤色泽较黑。,L-酪氨酸的酶法合成,L-酪氨酸是目前仍采用水解法生产的少数氨基酸之一，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸是近年来氨基酸工业的研究热点之一。酪氨酸酚裂解酶（tyrosine phenol-lyase），也称-酪氨酸酶，在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸
4、和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸而L-酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必须氨基酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。,酪氨酸酚裂解酶主要分布于肠细菌内，也存在于一些嗜热菌和节肢动物体重，其中酶活较高的微生物主要是草生欧文氏菌、中间柠檬酸菌、弗氏柠檬酸以及嗜热菌和Symbi-obacterium toebii等。近年来，来源于上述微生物的TPL，其空间结构和作用机制已得到较深入研究，并在工业化应用方面取得重要进展。,弗氏柠檬酸菌的培养及破碎,弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)枸橼酸杆菌属(Citrobacter)。该菌革兰氏阴性，
5、需氧或兼性厌氧，为条件致病菌，广泛分布于自然界中，是人和动物(哺乳类、鸟类、爬行类及两栖类)肠道内正常的菌群。药物敏感性试验结果表明，该菌对氟罗沙星、头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星、依诺沙星、氧氟沙星、左氟沙星等7种抗生素高度敏感。,特征特性：革兰阴性杆菌，有周鞭毛，能运动，无芽胞，无荚膜。具有氨苄青霉素（Ampr）、卡那霉素（Kanr）、四环素（Tcr）及链霉素（Strr）抗性。光滑、低凸、温润、半透明或不透明，表面有光泽，边缘不整齐。菌体杆状，直径1.0，长26m。菌落直径24mm。出芽繁殖为主，酒类增香。用于白酒增香。可以含有10ppm MG的无机盐培养基中正常生长，最适生长温度为30。,
6、实验材料：菌株：弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii)试剂：LB培养基：配方：酵母提取物 5g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、琼脂 1520g 、水 1000mL（调节pH 7.47.6）,实验操作,1.菌种培养：配制培养基菌种活化待灭菌后的固体培养基冷却至50时，倒入平板中（大约每平板15mL），待平板凝固后，挑取菌种进行划线接种。接种好的平板倒置于培养箱中，37培养24h。扩大培养：挑取上面培养好的菌落，放入已灭菌好的液体培养基的三角瓶中进行扩大培养。37、200r/min摇床过夜培养。（培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多）,2.破碎细胞菌体收集：取已经培养过
7、夜的弗氏柠檬酸菌菌悬液于离心管中，3000r/min离心5min，弃上清液，收集菌体。细胞破碎：向离心后的沉淀中加入Tris-HCL（PBS）缓冲液（1:20），在漩涡混合器混合。然后再超声破碎仪下破碎，功率和时间根据菌液多少确定。功率不得太高，不要起气泡。循环次数不要太多，运行2s，间歇6s。冰上破碎效果更佳，菌液破碎前为乳白色，破碎后为透明。收集破碎液：将破碎好的液体倒入离心管中离心，3000r/min离心5min。弃沉淀，上清液备用。,酪氨酸酚裂解酶的活力测定：福林酚试剂时磷铂酸与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后
8、产生的酪氨酸可与福林酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。,用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，收率低，环境污染严重，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸具有重要的应用价值。用TPL合成L-酪氨酸，首先开展的工艺是丙酮酸路线。,Para等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的C.intermiedius固定化细胞作为催化剂，分批添加底物，建立75mmol/L丙酮酸钠、45mmol/L硫酸铵、45mmol/L氯化铵和55mmol/L苯酚的转化体系，反应5h后可积累L-酪氨酸10g/L。若将反应体系置于连续的柱反应器内，苯酚对L-酪氨酸的转化率达90%，且稳
9、定性可维持5d。,酶法合成产物L-酪氨酸的分析鉴定,实训原理：纸层析法是利用各物质不同的分配系数，使混合物随流动相时而得到分离的方法。纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的。滤纸纤维与水亲和力较强，而与有机溶剂亲和力弱，所以纸层析以滤纸纤维和结合水为固定相，以有机溶剂为流动相。当有机相沿滤纸流动经过样品点时，样品点上的溶液在水相和有机相之间进行分配，样品移动速率与样品的极性及水亲和力有关，因此，极性氨基酸移动较慢，而非极性氨基酸移动较快。,实训器材及试剂：层析缸、毛细管：5只/组、培养皿：1只/组、层析滤纸（长16cm、宽16cm的）：1张/组、直尺、铅笔、电吹风、针、白线、小试管：4只/组、移液管
10、、喷雾器。,1.展层剂和平衡液：正丁醇：冰醋酸：水=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上层做展层剂；下层液（弃去）。2.样品液：用水配成酶1mL含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各mg/mL的氨基酸溶液，以及上述四种氨基酸的混合液（各4mg/mL）3.茚三酮：按展层剂0.25%的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。,实训操作：1.检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120烘干。2.规划：取宽约16cm、高约16cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处划一条平行于左边缘的
11、直线B，在B线以上A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位）。,3.点样：在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或冷风吹干后再点第二次。前三种氨基酸各点3次，混合液点6次。将点过样的滤纸用针线卷成筒状（点样面向内），注意纸的两边不能接触，留一定缝隙。注意：点样用的毛细管和试剂瓶上的氨基酸是一一对应的，千万不能混淆，以免污染。,4.层析：将培养皿中放入2/3量的展层剂，迅放置于层析缸中。把滤纸筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点。当溶剂前言到达滤纸2/3处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿。注意：点
12、样端朝下，点样处不能没入层析液中，滤纸不能贴壁。显色：热风吹干滤纸至显出氨基酸斑点，用铅笔描出轮廓。,参考文献,1杨金奎,何璧梅.微生物方法生产L-半胱氨酸的研究进展J.国外医药(抗生素分册).2001(04);2薛文华.电化学法制备L-半胱氨酸的研究J.广州化工.2012(13);3吴玉芹;陈金龙.水溶性蓝光发射金量子点灵敏检测L-半胱氨酸J.应用化学.2013(02);4朱婉华.L-半胱氨酸盐酸盐的电化学合成法及其应用J.南京大学学报(自然科学版).1986(03);5周昌平;怀丽华;白钢;杨文博;陈宁.酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶促反应条件研究J.生物技术通讯.2006(06);6周新月.蚝油酶法生产工艺的研究J.食品工业科技.1994(04);7马少敏;韦航;蒙健宗.酶法生产海藻糖的定量分析方法J.大众科技.2008(10);8张晓驷,冯静波.功能性蛋白短肽的蛋白酶法生产研究J.中国饲料.2004(19).,请批评指正,
