1、FISH 检测HER-2 的意义乳腺癌有效的治疗取决于正确的选择治疗方案，肿瘤专家研究发现 HER-2的水平是以阿霉素为基础药物化疗重要而独立的预后因子。HER-2 水平的检测被认为是选择乳腺癌化疗的标准依据。 HER-2水平的检测对乳腺癌治疗具有指导性意义。不准确的结果会造成不正确的治疗方案。导致病人遭受不必要的化疗或者使病人丧失有效的治疗良机。HER-2/neu也称作 CerbB-2，在调节细胞的生长中起着重要的作用，是分子量为 185kd的转膜细胞受体，属于酪氨酸酶家族的成员。HER-2 被证实在乳腺癌、卵巢癌和其它肿瘤上扩增和过表达。其扩增和过表达被认为是乳腺癌最重要预后和化疗标记。大
2、约有 25%-30%乳腺癌有 HER-2基因扩增。化疗是乳腺癌术后最重要的治疗方法之一，患者肿瘤 HER-2扩增对以阿霉素为基础化疗的敏感性好，研究表明，HER-2 扩增的病人实施强化剂量的化疗后其生存率明显提高。而对无 HER-2扩增的病人没有那么好的效果。所以对无 HER-2扩增的病人没有必要执行这样的化疗。准确的 HER-2水平检测为正确选择治疗方案提供重要依据。目前用于治疗乳腺癌的单克隆抗体 Herceptin理论上只对细胞膜上过多 HER-2蛋白表达的细胞才有作用，所以 Herceptin治疗需要筛选 HER-2阳性的患者才有可能成功。目前检测 HER-2基因扩增或 HER-2蛋白过
3、度表达的方法有许多种，有南方点墨法、西方点墨法、北方点墨法、免疫组织化学染色法（IHC）和荧光原位杂交法（fluorescence in situ hybridization;FISH）等。目前 DAKO Herceptin test， Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe试剂盒和 Oncor INFORM HER-2/neu已通过美国食品药物管理局（FDA）的认证，目前被认为是比较可靠的方法。IHC和 FISH均可以使用福尔马林固定的组织蜡块来检测，和一般病理组织标本处理相同，病理存档的组织块也能用于 HER-2的检测，因此目前实验室多数使用 IHC和 FISH
4、来检测 HER-2。Herceptin test 和 FISH相比 Herceptin test操作时间比较短，大约 4-6个小时即可完成，而 FISH需要隔夜完成。使用的设备 Herceptin test只需要一般光学显微镜，FISH则需要使用荧光显微镜。从分子生物学原理上讲 FISH检测的是肿瘤细胞的 DNA，而Herceptin test（免疫化学法）检测的是细胞膜表面的蛋白质。实际上真正执行基因功能的物质是蛋白质而不是 DNA，这要看 HER-2基因是否扩增，当然以观察细胞膜表面 HER-2蛋白质的量是否增加最为直接。也最为可信。因为有时即使 DNA有扩增其结果未必能在蛋白质曾面表现出
5、来。因为由 DAN有表现到蛋白质被制造出来必须经过很多程序，中间可能出现很多干扰因素。除此之外，免疫化学检测法比较便宜，省时，可以较普遍的筛选。FISH的优点在于使用传统分子生物学方法检测肿瘤组织的 DNA。FISH 在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在的位置，以 Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe来说，它会把HER-2基因部位橘色荧光亮点，还将第 17对染色体的中心颗粒（centromere）呈现绿色亮点，我们只要对比橘色和绿色亮点的数目，若橘色点/绿色点大于 2，就表示有 HER-2扩增，正常细胞橘色点/绿色点数目比值小于 2。FISH同 IHC HER-2水平
6、检测方法相比，IHC 检测的准确性不如原位杂交（CISH）和原位荧光杂交法（FISH） 。就各种检测方法比较 FISH为最好，FISH 检测的结果可靠，被喻为HER-2水平检测的金标准。 HER-2 免疫组织化学+2 的意思是肿瘤组织在免疫组织化学染色下着色强度为 2价。多数认为 HER-2 +3（3 价）具有临床意义，可以作为使用 Herceptin治疗的依据。her-2 IHC+2则必须加作 FISH检测是否真的有 HER-2扩增。而 HER-2 IHC 0或+1 则表示没有没有HER-2过表达，不必再作 FISH，也不适合使用 Herceptin治疗。FISH 检测方法试剂和仪器Vysi
7、s提供的材料根据订货该盒内含有大约足够检测 20，50 和 100人份试剂。限定一份检测 22 x 22mm靶区。1） LSI HER2/neu黄色光谱（low copy number E. coli vector）/CEP 17 绿光谱 DNA探针（E.coli plasmid）Vysis P.N ( product number): 30-17060/35-171060Quantity: 200uL/500uL/500uLx2 for the 100 assay kitStorage: -20 in the darkComposition (成分): SpetrumGreen fluoro
8、phore-labeled alpha satellite DNA probe for chromosome 17, SpectrumOrange fluophore-labeled DNA probe for the HER-2/neu gen locus, and blocking DNA, pre-denatured in hybridization buffer.2) DAPI ConuterstainVysis P.N: 30-804840/30-804860/30-804960Quantity: 300uL/600uL/1000UlStorage: -20 in the darkC
9、omposition: 1000ng/mL DAPI (4,6-diamino-2phenylindole) in phenylenediamine dihydrochloride, glycerol, and buffer.3) N P-40Vysis P.N: 30-804820Quantity: 4mL (2 vials)Storage: -20 to 25Composition: N P-404) 20 XSSC saltsVysis P.N: 30-805850Quantity: 66g for up to 250mLof 20 X SSC solutionStorage: -20
10、to 25Composition: sodium chloride and sodium citrateNote: Material Safety Data Sheets (MSDS 材料安全数据表) for all reagents provided in the kits are available upon request from the Vysis Technical Department.Storage and handling 贮存和处理未开封的 Path Vysis 试剂盒-20贮存并避光和潮湿。20 X SSC 盐和 NP-40可以单独贮存于室温。每一种成分包装上面都标明了有
11、效期。同时也标明了打开和未开包装的贮存条件。试剂盒中的某些成分接触光、热或潮湿会影响试剂的有效期，应该避免。不按包装规定的条件保存可能会影响检测结果。需要的材料但 Vysis公司不提供实验室试剂 HER-2/ nue探针检测正常对照（正常信号率）order No.30-805093 福尔马林固定，石蜡包埋，培养好的人细胞株（normal LSI HER-2/nue;CEP 17 ratio）应用型显微镜载玻片数量：5 片，对照片在 15-30干燥剂防潮密封在容器中贮存。 HER-2/ nue探针界限对照片（弱扩增信号率）order No.30-805042；福尔马林固定，石蜡包埋。培养好的人细
12、胞株（低水平 HER-2/ nue扩增）应用型显微镜载玻片数量：5片，对照片在 15-30干燥剂防潮密封在容器中贮存。 石蜡预处理试剂盒（Vysis cat.32-801200）盒内包括： 预处理液（NaSCN）数量：5 X 50mL 蛋白酶（胃蛋白酶 2500-3000单位/mg）数量：5 X 25mg 蛋白酶缓冲液（NaCl solution, pH 2）数量：5 X 50Ml 缓冲洗液（2 X SSC，pH 7）数量：2 X 250mL 中性缓冲福尔马林液（4%多聚甲醛 PBS配制） Hemo-De ( 血液德)透明剂（Fisher product No.15-182-507A） 苏木精
13、和伊红（H&E） 适当的荧光显微镜浸泡油。室温贮存 超纯甲酰胺。从发货计算 4保存 1个月（查看生产商推荐的详细信息） 100%乙醇。室温贮存 浓缩的（12N）盐酸 1N氢氧化钠 纯净水（蒸馏水或去离子水或 Milli-Q） 。室温贮存 橡胶水泥胶 Drierite德里拉特干燥用无水硫酸,商品名和液氮实验室设备 预清洁硅化或正电荷显微镜载玻片 载玻片加热器（要求有准确的温度数字显示）45-50 22 mm X 22 mm玻璃盖玻片 可调容积吸管（1-10 uL）和无菌微量移液管头 聚丙烯微量离心管（0.5-1.5mL ） 计时器 切片机 磁力搅拌器 漩涡混合器 微量离心机 刻度量筒 水浴锅（3
14、71，721和 801） 水浴（40）无蛋白质 干燥箱（37-56） 钻石笔 杂交湿盒 镊子 一次性注射器（5 mL） 染色缸（6）建议型号：Wheaton Product No.900620 竖式染色缸 荧光显微镜设备和推荐的滤光片（见第二部分） pH计和 pH试纸 温度计 带盖载玻片盒 0.45细孔过滤设备显微镜设备和附属品显微镜：观察原位杂交结果需要一种磊照明荧光显微镜，如果有合适的荧光显微镜。应该检查荧光显微镜是否能较好的观察原位杂交样品。用老式显微镜一般 DNA染色例如 DAPI，碘化丙啶和奎纳克林不具备足够的功能进行 FISH检测。显微镜常规清洁和定期调试应该由生产商家的技术人员完
15、成。注释： Often a presumed failure of reagents in an in situ assay may actually indicate that a malfunctioning or sub-optimal fluoroscope or incorrect filter set is being used to view a successful hybridization assay.激发光源：100W 汞灯它的大约寿命 200小时是推荐的激发光源。汞灯用后应该记录使用小时数。超过规定的时间之前应该更换。确保汞灯适当的应用。接物镜：显微镜汞灯 100W使用
16、的荧光接物镜浸泡油数值孔径0.75。一个 40X 接物镜用10X目镜连接适合扫描。对 FISH分析用 63X或 100X油浸消色差透镜型接物镜就可以获得满意的结果。浸泡油：油浸接物镜使用的浸油，是一种低自发荧光和专用荧光显微镜的配方。滤光片：多带通荧光显微镜滤片装置最适合用于 CEP和 LSI DAN 探针试剂盒可以从 Vysis 获得一些显微镜滤片型号。Path Vysion 试剂盒推荐滤片装置是 DAPI/9-Orange 双带通，DAPI/Green双带通和 DAPI/Green/Orange三重带通。LSI HER-2/nue原位杂交和 CEP17探针对它们的靶区分别标记橙色和绿色荧光
17、。其它所有 DNA DAPI染色为绿色荧光。工作液的准备20X SSC（3M 氯化钠，0.3M 柠檬酸钠，pH 5.3）配制 20X SSC pH 5.3 加入的顺序：66g 20X SSC200mL 纯化水250mL 最终量彻底混合，用 pH计室温下测 pH，用浓盐酸调 pH到 5.3。加纯水至总量 250没 mL。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。室温贮存 6个月。变性液（70%甲酰胺/2X SSC，pH 7.0-8.0）配制甲酰胺的顺序：49mL 甲酰胺7mL 20X SSC, pH5.314mL 纯化水70mL 最终量彻底混合，用 pH计室温下测 pH，用玻璃电极（glass ele
18、ctrode 利用薄玻璃膜将两种溶液隔离而产生电势差的电极，常用于测量溶液的 pH）调 pH至 7.0-8.0之间。液体可以保存一周。每次用前检查 pH。贮存于 2-8，不用的时候盖紧容器的盖子。乙醇液用 100%乙醇和纯化水 v/v稀释 70%，80%。避免蒸发或稀释过量，不用的时候盖紧容器的盖子。配制后可以使用一周。后杂交缓冲洗液（20X SSC/0.3% NP-40）配制顺序：100mL 20X SSC, pH 5.3847mL 纯化水3mL NP-401000mL 最终量彻底混合，用 pH计室温下测 pH，用 1 N氢氧化钠调 pH至 7.0-7.5。加纯化水到总量1000mL。通过
19、0.45um孔径的过滤设备过滤。使用过的液体当日丢弃，未使用过的液体室温贮存 6个月。注意事项和预防措施1 Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe kit用于体外诊断使用。2 The PathVysion Kit 仅用于福尔马林固定石蜡包埋乳腺癌组织；不作为新鲜组织或非乳腺癌组织使用。3 所有生物学标本经过防止传染病传递的药剂处理。盒子里提供的是人细胞株经过 10%福尔马林固定的对照细胞涂片。因为常常不清楚是否会引起传染，所有人标本和对照片是经普遍预防处理。标本处理指南从美国疾病控制中心获得。4 标本应该避免酸，强碱或过热，这样的条件会破坏 DNA引起 FISH检测
20、失败。5 下面所有步骤对标本变性，杂交和检测可以引起不可接受失败或错误的结果。6 相同组织块的第 10张切片应该进行 H.E染色对靶区进行辨认。7 使用其它试剂代替 Vysis公司提供的试剂可能对杂交条件产生不利的影响。8 确保标记的有效期以盒子上正确贮存说明为基础，不按贮存说明要求存放可能对检测结果不利。9 如果贮存在低温，20X SSC可以出现结晶，如果结晶在室温下不能再溶解，该液应该丢弃。10 如果其它工作液沉淀或浑浊应该丢弃，从新配制新工作液。11 该 DAPI对比染色含有 DAPI（ 4,6-二氨基-2-苯基吲哚）和 1,4苯二胺。DAPI是一种可能的诱变剂明确建立在遗传毒性影响的基
21、础上。1,4 苯二胺被认为是一种皮肤致敏剂和一种可能的呼吸致敏剂，避免吸入，摄取或皮肤接触。参考 MSDS详细警告。12 荧光暴露在光线下容易被光漂白，限制这种降级。操作所有含荧光的液体时要减少光线暴露。所有步骤牵涉到处理杂交的切片。所有（孵育、洗等）步骤不要在光线下应该在暗处操作。13 LSI HER-2/neu CEP17 DNA 探针混合物含有甲酰胺，一种致畸因子。避免接触皮肤和黏膜。14 校准温度需要测量液体、水浴锅和恒温箱的温度。15 总要核实预处理液，变性液和洗液的温度，使用前用标准温度计对科普林缸内液体进行测量核对温度。16 所有有危险的物质应该按当地和国家指导方针进行无害化处理
22、。标本处理和载玻片准备标本收集和处理Path Vysion 试剂是为福尔马林固定石蜡包埋的组织样品检测而设计的，组织收集应该按照实验室标准程序执行。Path Vysion 检测对组织的选择应该由病理学家完成。标本避免接触酸，强碱或非常高的温度。这种情况会破坏 DNA导致 FISH检测失败。切片厚度 4-6微米，福尔马林固定，石蜡包埋的组织可以按照实验室常规步骤处理和贮存。确保 Path Vysion 试剂盒检测的最佳结果，对所有标本分析这些方法应该一致。用于 FISH检测分析组织块的第 10张作 H.E染色，以便对靶区进行辨认。组织切片应该贴在胶包被载玻片的正面，以便在 FISH检测中脱片。P
23、ath Vysion 试剂盒有足够检测大约 20人份的试剂；每份限定 22mm X 22mm区域。较大的组织切片超过 22mm X 22mm区域每份加探针应该大于 10uL。福尔马林固定石蜡包埋组织切片准备使用下列方法进行准备1. 切片 4-6微米。2. 切片飘在无蛋白质 40水中。3. 贴在有机硅烷胶包被载玻片的正面。4. 让切片在空气中干燥。 （Start processing ProbeChek control slides here）5. 烤切片 56过夜。切片预处理在进行 Path Vysion 试剂盒检测前标本需要经过固定，切片必须脱蜡。Path Vysion预处理试剂盒插在包装中
24、， （Product No. 32-801200）含有详细的说明。下面是简要的步骤说明。切片脱蜡切片浸在 Hemo-De 10min，室温。用新 Hemo-De重复两次。切片在 100%乙醇 5min，室温，重复。空气干燥切片或把切片放在 45-50载玻片加热器上。预处理切片切片浸在 0.2N HCI 20 minutes切片浸在纯化水中 3 minutes切片浸在缓冲洗液中 3 minutes切片浸在预处理液中 80 30 minutes切片浸在纯化水中 1 minutes切片浸在缓冲洗液中 5 minutes，重复蛋白酶处理在载玻片边缘用纸巾吸干载玻片上过多的缓冲液切片浸在蛋白酶液中 37
25、，10 minutes切片浸在缓冲洗液中 5 minutes， 重复干燥切片在 45-50载玻片加热器上 2-5 minutes。标本固定切片浸在中性缓冲福尔马林液中，室温，10 minutes。切片浸在缓冲洗液中 5 minutes， 重复干燥切片在 45-50载玻片加热器上 2-5 minutes。继续 the Path Vysion 检测拟订计划FISH测试步骤Fluorescence In Situ Hybridization Procedure Summary样品 DNA变性探针液 DNA变性和杂交步骤准备工作应该同步进行。1 将杂交用的湿盒在 37中预热（湿盒内放有湿纸巾） 。2
26、使用前在室温下将变性液 pH调到 7.0-8.0，把变性液加入玻片染色缸内（Coplin jar）而后在 721水浴至少 30min或变性液达到 721，使用前测量温度。3 使用钻石笔尖划刻标记杂交区域。4 将准备好的切片放入到达到 721的变性液中（6 片/缸）5min。 Note: Verify the solution temperature before each use. 5 用镊子从变性液中取出切片并立即放入室温 70%酒精洗液中。摇动切片去除甲酰胺，让切片在酒精中维持 1min。6 从 70%酒精取出栽玻片，放入 80%酒精，再入 100%酒精。7 载玻片的底部接触到一个小瓶子排
27、掉载玻片上过多的酒精，用实验室纸巾擦干载玻片的底面。8 放在 45-50载玻片加热器上 2-5min。探针准备1 室温下让探针复温，降低探针的黏度，以便探针充分准确吸取。2 涡流混合。把内容物装入试管底部，每个试管用台式离心机离心 2-3秒，然后再次轻轻涡流混合。杂交1 加 10uL混合后的探针到载玻片的靶区，立刻在探针上加盖 22mm X 22mm盖玻片，让探针均匀的在盖玻片下扩散。气泡会干扰杂交应该避免。探针使用后需要及时再冷冻保存。2 按下列方法用橡胶水泥密封盖玻片：用 5mL注射器抽橡胶水泥，在盖玻片的周围注射少量的橡胶水泥于盖玻片和载玻片交界处重叠，因此在盖玻片和载玻片周围形成密封圈
28、。3 把载玻片放入预热的杂交湿盒中，盖紧湿盒的盖子 37过夜（14-18 小时）杂交后洗涤1 加杂交后缓冲洗液（2X SSC/0.3%NP-40）到玻片染色缸内。放进 721水浴中预热杂交后缓冲洗液至少 30min或液体温度已经达到 721。 注：在每次洗浴之前洗液的温度必须回到 721 。 2 室温下加杂交后缓冲洗液到第二个玻片染色缸。洗液使用 1天后都要丢弃。3 首先用镊子轻轻拉掉密封剂，去除载玻片上密封的橡胶水泥。4 在室温下将载玻片浸入杂交后缓冲洗液中漂洗掉盖玻片。5 盖玻片小心被去掉后，吸干载玻片边缘过多液体，把载玻片浸入杂交后缓冲洗液中7212min(6 片/缸） 。6 从杂交后缓冲液中移出每张载玻片，把载玻片放在暗处竖立空气中干燥。 （关闭抽屉或关闭贵出门足可以）7 加 1010uLDAPI复染载玻片靶区并加盖盖玻片。在信号计算前载玻片贮存于暗处。载玻片贮存在暗处杂交载玻片（带有盖玻片）贮存于-20。使用荧光显微镜时，先从-20移出来让载玻片达到室温。
