1、动物肝脏中 DNA 的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA，为英文 Deoxyribonucleic acid 的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己 DNA 的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。DNA 是高分子聚合物，DNA 溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA 对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对 DNA 进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。较高温
2、度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA 分子变性，即 DNA 双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开也称为 DNA 的解螺旋。在细胞内，DNA 能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。对于人类而言，正常的体细中含有 46 条染色体。染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1 期-DNA 合成前期、S 期-DNA 合成期、G2-DNA 合成后期。对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟核内。染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将 DNA 进行组织并压缩，以帮助 D
3、NA 与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。脱氧核糖核酸的结构DNA 的结构： DNA 的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。DNA 是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP 脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP 脱氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP 脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP 脱氧鸟苷）。而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着 DNA 长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。读取密码的过
4、程称为转录，是以 DNA 双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA（信使 RNA）的核酸分子。DNA 是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用 3， 5-磷酸二酯键相连构成的长链。大多数 DNA 含有两条这样的长链，也有的 DNA 为单链，如大肠杆菌噬菌体 X174、G4、M13 等。DNA 有环形 DNA 和链状 DNA 之分。在某些类型的 DNA 中，5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚 DNA 的 5-甲基胞嘧啶特别丰富。在某些噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40 年代后期，查加夫（E.Chargaff）发现不同物种 DNA 的碱基组成不同，但其中的腺嘌呤数等于其
5、胸腺嘧啶数（A=T），鸟嘌呤数等于胞嘧啶数（G=C），因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和，一般用几个层次描绘DNA 的结构。浓盐法从动物组织中提取 DNA核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在，其中 DNP 能溶于水及高浓度盐溶液，但在 0.14 M 的盐溶液中溶解度很低，而 RNP 则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的 NaCl 溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的 DNP 用 SDS 处理可将其分离 DNA 和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得 DNA 上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。肝脏细胞肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才
6、能看到。人肝约有 25 亿个肝细胞，5000 个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有 50 万个。肝细胞为多角形，直径约为 20-30/加(微米)，有 6-8 个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构:如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。二、实验目的1.掌握浓盐法从动物组织中提取 DNA 的原理与技术三、实验原理核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在，其中 DNP 能溶于水及高浓度盐溶液，但在 0.14 M 的盐
7、溶液中溶解度很低，而 RNP 则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的 NaCl 溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的 DNP 用 SDS 处理可将其分离 DNA 和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得 DNA 上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。四、实验器材和材料试剂实验器材：匀浆器量筒离心机离心管试管吸管恒温水浴锅实验材料：猪肝实验试剂：0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 柠檬酸钠溶液（pH6.8）95%乙醇（A.R.）NaCl 固体（A.R.）5%SDS 溶液（5g SDS 定容至 100ml）V(氯仿)：V（异戊醇）20：1 的混合液五、实验操作1.称量称取一定
8、质量的猪肝，加入 2 倍肝重的 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎（已完成）。2.提取 DNA量取肝糜 4 ml 于 10 毫升离心管，在 4000r/min 下离心10min ，沉淀中再加入 8 ml 缓冲液于 4000r/min 离心 5 min；弃上清，取沉淀；将沉淀用 10 ml 柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、加入 5 ml 氯仿-异戊醇混合液、1 ml SDS，振荡 30min（保鲜膜封口）；缓慢加入固体 NaCl（约 0.9g），使其最终浓度为 1mol/L；将溶液分装到 2 个 10 毫升离心管中，在 4000r/min 离心 5
9、min，取上清水相；在上述水相溶液中分别加等体积冷 95%乙醇，边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得 DNA 粗品；用 8ml 蒸馏水溶解 DNA 粗品于 10ml 离心管中。3.标准曲线的绘制按下表加入各种 试剂，混匀，于 60恒温水浴锅 45min，冷却后，在 595nm 波长下于分光光度计比色测定，以吸光度对 DNA 浓度作图，制作标准曲线。0 1 2 3 4 5标准 DNA 溶液/ml0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0蒸馏水/ml 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0二苯胺试剂/ml4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
10、4.0A595nm4.样品的测定将 DNA 粗品定容至 25ml 容量瓶，再取 DNA 样液 1.0ml，加入蒸馏水 1.0ml，混匀。然后准确加入二苯胺试剂 4.0ml，混匀，于60恒温水浴锅 45min，冷却后，595nm 波长下于分光光度计比色测定，根据所测的吸光度对照标准曲线求得 DNA 的质量（ug）。5.计算 100g 猪肝中 DNA 含量w=m1/m2100%w：DNA 的质量分数（%）m1：样液中测得的 DNA 的质量（ug）m2：样液中所含样品的质量（ug）六、实验数据处理1.标准曲线0 1 2 3 4 5标准 DNA 溶液/ml0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
11、蒸馏水/ml 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0二苯胺试剂/ml4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0A595nm 0 0.039 0.09 0.146 0.197 0.249DNA 含量/ug 0 80 160 240 320 4002.实验结果处理猪肝质量为 2.04gDNA 提取液体积为 12.53ml序号 1 2 3A595nm 0.102 0.102 0.101平均 A595nm 0.102样液中 DNA 含量/ug 171.4样液中样品质量/g 0.1628根据公式w=m1/m2100%得：w=0.1053则 100g 猪肝中 DNA 含量为：w100=0.1053
12、g七、思考题1.实验中的乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用？答：柠檬酸的钠盐在实验中既充当 DNA 酶的抑制剂，也是 pH缓冲溶液；SDS 是表面活性剂，可以让蛋白质与 DNA 分开；氯仿是有机溶剂，可以使蛋白质聚集沉淀，便于分离出去；异戊醇是消泡剂，可以减少泡沫的发生；氯仿-异戊醇的作用是使蛋白质变性、膜溶解；NaCl 固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液，在这样的环境中 DNA 核蛋白能溶解，RNA 核蛋白则溶解度很低，可以利用这一性质分离两种核酸。八、实验注意事项1.DNA 主要集中在细胞核中，因此，通常选用细胞核含量比例大的生活组织作为提取制备 DNA 的材料，
13、小牛胸腺组织中细胞核比例较大，因而 DNA 含量丰富，同时其脱氧核苷酸酶活性较低，制备过程中 DNA 被降解的可能性相对较低，所以是制备 DNA 的良好材料，但其来源较困难，脾脏或肝脏易获得，也是实验室制备 DNA 常用的材料，本实验用新鲜肝脏作为实验材料。2.为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，须采取以下措施：整个过程必须在低温下进行，可加入某些物质抑制核酸酶的活性，如柠檬酸钠、EDTA、SDS 等，EDTA 是抑制核酸酶的活性最好的抑制剂。3.从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多，经常采用的有：氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等，他们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚，并释放出核酸。4.使用离心机时
14、，对称放置的离心管必须用天平调平衡。5.避免剧烈振荡，如研磨过程、搅拌过程等。九、实验结果误差分析及讨论经过对本次实验结果进行分析，得出 100g 猪肝中 DNA 含量大约为0.1053g 的结论，在上网查阅相关资料后发现：猪肝中 DNA 含量与本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合。由此可知，本次试验结果是相对比较成功的，较为粗略地测量出猪肝中 DNA 的含量，并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取 DNA 的原理与技术，基本达到了本次实验的目的。但是本次实验结果只是粗略测量，并未达到精确测量猪肝中DNA 的含量，且实验数据较理论值偏低，这是由于某些误差导致，在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差，经分析得出以下几点：在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中，由于猪肝组织表面较滑不易磨碎，且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残留，因此可能导致猪肝中 DNA 提取不充分，致使实验数据较理论值偏低；
