1、 1 / 13高通量测序领域常用名词解释大全什么是高通量测序？高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统 Sanger 测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing， NGS )足见其划时代的改变 , 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。什么是 Sanger 法测序（一代测序）Sanger 法测序利用一种 DNA 聚合酶来延伸结
2、合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在 G、A、T 或 C 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs 和 ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通2 / 13过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用 X-光胶片放射自显影或非同位素标记
3、进行检测。什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing）全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。什么是 de novo 测序de novo 测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，
4、从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。3 / 13测序名词关系图什么是 fragmentsfragments 就是打成的片段，而测序测的就是这些 fragments，测出来的结果就是 reads，又可以分为单端侧和双端侧，单端测序的话，只是从 fragments的一端测序，测多长 read 就多
5、长，双端测序就是从一个 fragments 的两端测，就会得出两个 reads什么是 Reads 高通量测序平台产生的序列就称为 reads。(测序读到的碱基序列片段，测序的最小单位；)什么是 Contig拼接软件基于 reads 之间的 overlap 区，拼接获得的序列称为 Contig（重叠群）。(由 reads 通过对 overlap 区域拼接组装成的没有 gap 的序列段；)什么是 Contig N50Reads 拼接后会获得一些不同长度的 Contigs。将所有的 Contig 长度相加，能获得一个 Contig 总长度。然后将所有的 Contigs 按照从长到短进行排序，如获4
6、/ 13得 Contig 1，Contig 2，Contig 3.Contig 25。将 Contig 按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到 Contig 总长度的一半时，最后一个加上的Contig 长度即为 Contig N50。举例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3 +Contig 4=Contig 总长度*1/2 时，Contig 4 的长度即为 Contig N50。Contig N50 可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准。什么是 Scaffold基因组 de novo 测序（没有参考基因组的测序，需要研究人员从头拼接得到的序列），通过 reads 拼接
7、获得 Contigs 后，往往还需要构建 454 Paired-end 库或 Illumina Mate-pair 库，以获得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些序列，可以确定一些 Contig 之间的顺序关系，这些先后顺序已知的 Contigs 组成 Scaffold。(通过 pair ends 信息确定出的 contig 排列，中间有 gap)什么是 Scaffold N50Scaffold N50 与 Contig N50 的定义类似。Contigs 拼接组装获得一些不同长度的 Scaffolds。将所有的 Scaffold 长度相加，能获得一个 Sc
8、affold 总长度。然后将所有的 Scaffolds 按照从长到短进行排序，如获得 Scaffold 1，Scaffold 2，Scaffold 3.Scaffold 25。将 Scaffold 按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到 Scaffold 总长度的一半时，最后一个加上的Scaffold 长度即为 Scaffold N50。举例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold 总长度*1/2 时，Scaffold 5 的长度即为 Scaffold N50。Scaffold N50 可以作为基因组
9、拼接的结果好坏的一个判断标准。什么是测序深度和覆盖度测序深度：是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因大小为 2M，测序深度为 10X，那么获得的总数据量为 20M。覆盖度：是指测序获得的序列占整个基因组的比例。Gap：由于基因组中的高 GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，这部分没有获得的区域就称为。例如一5 / 13个细菌基因组测序，覆盖度是 98%，那么还有 2%的序列区域是没有通过测序获得的。什么是 RPKM、FPKMRPKM,Reads Per Kilobase of exon model per Million mapp
10、ed reads, is defined in thisway Mortazavi etal., 2008:每 1 百万个 map 上的 reads 中 map 到外显子的每 1K 个碱基上的 reads 个数。假如有 1 百万个 reads 映射到了人的基因组上，那么具体到每个外显子呢，有多少映射上了呢，而外显子的长度不一，那么每 1K 个碱基上又有多少 reads 映射上了呢，这大概就是这个 RPKM 的直观解释。如果对应特定基因的话，那么就是每 1000000 mapped 到该基因上的 reads 中每kb 有多少是 mapped 到该基因上的 exon 的 readTotal exo
11、n reads:This is the number in the column with header Total exonreads in the row for the gene. This is the number of reads that have beenmapped to a region in which an exon is annotated for the gene or across theboundaries of two exons or an intron and an exon for an annotated transcript ofthe gene.
12、For eukaryotes, exons and their internal relationships are defined byannotations of type mRNA.映射到外显子上总的 reads 个数。这个是映射到某个区域上的 reads 个数，这个区域或者是已知注释的基因或者跨两个外显子的边界或者是某个基因已经注释的转录本的内含子、外显子。对于真核生物来说，外显子和它们自己内部的关系由某类型的 mRNA 来注释。Exonlength: This is the number in the column with the header Exon length inthe
13、row for the gene, divided by 1000. This is calculated as the sum of thelengths of all exons annotated for the gene. Each exon is included only once inthis sum, even if it is present in more 6 / 13annotated transcripts for the gene.Partly overlapping exons will count with their full length, even thou
14、gh theyshare the same region.外显子的长度。计算时，计算所有某个基因已注释的所有外显子长度的总和。即使某个基因以多种注释的转录本呈现，这个外显子在求和时只被包含一次。即使部分重叠的外显子共享相同的区域，重叠的外显子以其总长来计算。Mapped reads: The sum of all the numbers in the column with header Totalgene reads. The Total gene reads for a gene is the total number ofreads that after mapping have bee
15、n mapped to the region of the gene. Thus thisincludes all the reads uniquely mapped to the region of the gene as well asthose of the reads which match in more places (below the limit set in thedialog in figure 18.110) that have been allocated tothis genes region. A genes region is that comprised of
16、the flanking regions(if it was specified in figure 18.110), the exons, the introns andacross exon-exon boundaries of all transcripts annotated for the gene. Thus,the sum of the total gene reads numbers is the number of mapped reads for thesample (you can find the number in the RNA-Seq report).map 的
17、reads 总和。映射到某个基因上的所有 reads总数。因此这包含所有的唯一映射到这个区域上的 reads。举例：比如对应到该基因的 read 有 1000 个，总 reads 个数有 100 万，而该基因的外显子总长为 5kb，那么它的 RPKM 为：109*1000(reads 个数)/106(总reads 个数)*5000(外显子长度)=200 或者：1000(reads 个数)/1(百万)*5(K)=200 这个值反映基因的表达水平。FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped). FPKM 与 RP
18、KM 计算方法基本一致。不同点就是 FPKM 计算的是 fragments，而RPKM 计算的是 reads。Fragment 比 read 的含义更广，因此 FPKM 包含的意义也更广，可以是 pair-end 的一个 fragment，也可以是一个 read。什么是 soft-clipped reads当基因组发生某一段的缺失，或转录组的剪接，在测序过程中，横跨缺失位点及剪接位点的 reads 回帖到基因组时，一条 reads 被切成两段，匹配到不同的7 / 13区域，这样的 reads 叫做 soft-clipped reads，这些 reads 对于鉴定染色体结构变异及外源序列整合具有
19、重要作用。什么是 multi-hits reads由于大部分测序得到的 reads 较短，一个 reads 能够匹配到基因组多个位置，无法区分其真实来源的位置。一些工具根据统计模型，如将这类 reads 分配给reads 较多的区域。什么是外显子测序（whole exon sequencing ）外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域 DNA 捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的 SNP、Indel 等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。什么是 mRNA 测序 （RNA-seq）转录组学（tra
20、nscriptomics）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有 RNA（包括 mRNA 和非编码 RNA）的类型与拷贝数。Illumina 提供的 mRNA 测序技术可在整个 mRNA 领域进行各种相关研究和新的发现。mRNA 测序不对引物或探针进行设计，可自由提供关于转录的客观和权威信息。研究人员仅需要一次试验即可快速生成完整的 poly-A 尾的RNA 完整序列信息，并分析基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。简单的样品制备和数据分析软件支持在所有物种中的 mRNA 测序研究。什么是
21、 small RNA 测序Small RNA（micro RNAs、siRNAs 和 pi RNAs）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina 能够对细胞或者组织中的全部 Small RNA 进行深度测序及定量分析等研究。实验时首先将 18-30 nt 范围的 Small RNA 从总 RNA 中分离出来，两端分别加上特定接头后体外反转录做成 cDNA 再做进一步处理后，利用测序仪对 DNA 片段进行单向末端直接测序。通过 Illumina 对 Small RNA 大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的 miR
22、NA 图谱，实现包括新 miRNA 分子的8 / 13挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs 聚类和表达谱分析等科学应用。什么是 miRNA 测序成熟的 microRNA（miRNA）是 1724nt 的单链非编码 RNA 分子，通过与 mRNA 相互作用影响目标 mRNA 的稳定性及翻译，最终诱导基因沉默，调控着基因表达、细胞生长、发育等生物学过程。基于第二代测序技术的 microRNA 测序，可以一次性获得数百万条 microRNA 序列，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的 microRNA 及其表达差异，为研究 microRNA 对
23、细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。什么是 Chip-seq染色质免疫共沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与 DNA 相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将 ChIP 与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq 技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的 DNA 区段。ChIP-Seq 的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的 DNA片段进行高通量测序。研究
24、人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的 DNA 区段信息。什么是 CHIRP-SeqCHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一种检测与 RNA绑定的 DNA 和蛋白的高通量测序方法。方法是通过设计生物素或链霉亲和素探针，把目标 RNA 拉下来以后，与其共同作用的 DNA 染色体片段就会附在到磁珠上，最后把染色体片段做高通量测序，这样会得到该 RNA 能够结合到在基因组的哪些区域，但由于蛋白测序技术不够成熟，无法知道与该 RNA 结合的蛋白。什么是 RIP-seq9 /
25、 13RNA Immunoprecipitation 是研究细胞内 RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现 miRNA 的调节靶点。这种技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的 RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的 RNA 进行测序分析。RIP 可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀 ChIP 技术的类似应用，但由于研究对象是 RNA-蛋白复合物而不是 DNA-蛋白复合物，RIP 实验的优化条件与 ChIP实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP 反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有 RNA 酶，抗体需经 RIP 实验验证等等）
26、。RIP 技术下游结合 microarray 技术被称为 RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA 变化。什么是 CLIP-seqCLIP-seq,又称为 HITS-CLIP，即紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing), 是一项在全基因组水平揭示 RNA 分子与 RNA 结合蛋白相互作用的革命性技术。其主要原理是基于 RNA 分子与 RNA 结合蛋白在紫外照射下发生耦联，以 RNA 结合蛋白的特异性抗体将 RNA-蛋白质复合体沉淀之后，回收其中的
27、 RNA 片段，经添加接头、RT-PCR 等步骤，对这些分子进行高通量测序，再经生物信息学的分析和处理、总结，挖掘出其特定规律，从而深入揭示 RNA 结合蛋白与 RNA 分子的调控作用及其对生命的意义。什么是 metagenomic（宏基因组）：Magenomics 研究的对象是整个微生物群落。相对于传统单个细菌研究来说，它具有众多优势，其中很重要的两点：(1) 微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它们的很多特性是基于整个群落环境及个体间的相互影响的，因此做 Metagenomics 研究比做单个个体的研究更能发现其特性；(2) Metagenomics研究无需分离单个细菌，可以研究那些
28、不能被实验室分离培养的微生物。宏基因组是基因组学一个新兴的科学研究方向。宏基因组学（又称元基因组学，环境基因组学，生态基因组学等），是研究直接从环境样本中提取的基因组遗传物质的学科。传统的微生物研究依赖于实验室培养，宏基因组的兴起填补了无法在传统实验室中培养的微生物研究的空白。过去几年中，DNA 测序技术的10 / 13进步以及测序通量和分析方法的改进使得人们得以一窥这一未知的基因组科学领域。什么是 SNP、SNV （单核苷酸位点变异）单核苷酸多态性 singlenucleotide polymorphism，SNP 或单核苷酸位点变异SNV。个体间基因组 DNA 序列同一位置单个核苷酸变异(
29、替代、插入或缺失)所引起的多态性。不同物种、个体基因组 DNA 序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。有这种差别的基因座、DNA 序列等可作为基因组作图的标志。人基因组上平均约每 1000 个核苷酸即可能出现 1 个单核苷酸多态性的变化，其中有些单核苷酸多态性可能与疾病有关，但可能大多数与疾病无关。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。在研究癌症基因组变异时，相对于正常组织，癌症中特异的单核苷酸变异是一种体细胞突变（somatic mutation），称做 SNV。什么是 INDEL (基因组小片段插入）基因组上小片段（50bp）的插入或缺失，形同 SNP/SNV。什
30、么是 copy number variation （CNV）：基因组拷贝数变异基因组拷贝数变异是基因组变异的一种形式，通常使基因组中大片段的 DNA 形成非正常的拷贝数量。例如人类正常染色体拷贝数是 2，有些染色体区域拷贝数变成 1 或 3，这样，该区域发生拷贝数缺失或增加，位于该区域内的基因表达量也会受到影响。如果把一条染色体分成 A-B-C-D 四个区域，则 A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D 分别发生了 C 区域的扩增及缺失，扩增的位置可以是连续扩增如 A-B-C-C-D 也可以是在其他位置的扩增，如 A-C-B-C-D。什么是 structure variation （SV）：基因组结构变异染色体结构变异是指在染色体上发生了大片段的变异。主要包括染色体大片段的插入和缺失（引起 CNV 的变化），染色体内部的某块区域发生翻转颠换，两条染色体之间发生重组（inter-chromosome trans-location）等。一般 SV 的展示利用 Circos 软件。什么是 Segment duplication
