1、血清清蛋白、-球蛋白的分离、提纯与鉴定一、实验目的1. 掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法；2. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法；3. 了解柱层析技术。二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。1盐析蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析
2、法的原理是：中性盐如硫酸铵(NH ) SO4)等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析出。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。2脱盐盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，
3、常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。3.纯化（离子交换层析）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的 DEAE 纤维素是一种阴离子交换剂，溶
4、液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的 pI 各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过 DEAE 离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。4.纯度鉴定（电泳）血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于 pH7.4。它们在 pH8.6 的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)
5、、1- 球蛋白、 2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白 5 条区带。三、材料与方法：以流程图示意1.实验材料人血清、葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、0.3mol/l 的 PH6.5 醋酸铵缓冲液、0.06mol/l 的 PH6.5 醋酸铵缓冲液、0.02mol/l 的 PH6.5 醋酸铵缓冲液、1.5mol/l 的 NaCl-0.3mol/NH4AC 溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl2 溶液、电泳仪、电泳槽。2.实验方法1) 实验流程2) 实验步骤1 盐析：中性盐沉淀步骤步骤 操作（1）盐析 取离心管一个，
6、加入 0.8mol 人或动物血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液 0.8ml，混匀后室温下放置 10min，离心10min（4000r/min）。用滴管小心吸出上清液置于试管中，作为纯化清蛋白之用（2）溶解沉淀向离心管的沉淀加入 0.6mol 蒸馏水，振摇使之溶解，作为纯化球蛋白用注意：上层清夜尽量全部吸出，但不可吸出沉淀物。2 脱盐：过凝胶层析柱步骤粗 提 鉴 定纯 化脱 盐盐析法进行粗分离DEAE 纤维素离子交换层析葡聚糖凝胶层析醋酸纤维素薄膜电泳步骤 操作（1）调节层析柱液面葡萄糖凝胶 G-25 层析柱经 0.02mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲液流洗平衡后，取下恒压储液瓶管塞，小
7、心控制柱下端螺旋夹，使层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面（2）加样品 用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白质溶液，小心而缓慢的加入凝胶床上面，柱下端用 10ml 刻度离心管接液，拧松柱下螺旋夹，调节适当流速，使样品进入凝胶床，至液面降到凝胶床表面为止（3）洗层析柱 小心用 0.02mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲液洗涤层析柱内壁，以洗涤粘在柱壁上的蛋白质样品液（4）洗脱 待样品液进入凝胶床内，继续用 0.02mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲液流洗，同时注意流出液量注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床
8、。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。e.葡萄糖凝胶价钱昂贵，要回收再生避免损耗，严禁倒掉。3 球蛋白的纯化：过 DEAE 纤维素阴离子交换层析柱（5）检测及收集蛋白质在黑色反应板凹孔内加 2 滴 0.92mol/L 磺基水杨酸，随时检查流出液是否含有蛋白质，滴流出液 1 滴黑色反应板凹孔内接触到磺基水杨酸溶液，若出先白色混浊或沉淀，表示已有蛋白质流出（当凝胶床体积为 5.5ml 时，流出的液体量
9、约为 2ml 就可能有蛋白质流出），立即收集流出的蛋白质溶液。收集约 12滴后，滴流出液 1 滴于预先加有 1 滴 0.05mol/L(1%)BaCl2 的黑色反应板凹孔内，一旦见出现白色沉淀（表示有 SO42-），立即停止收集收集的蛋白质溶液即可分别过 DEAE 纤维素柱，进行离子交换层析(6)层析柱再生平衡收集蛋白质溶液后的凝胶层析柱继续用 0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液流洗，用 BaCl2 液检测层析柱流出液，当流出液用 BaCl2检查 SO42-为阴性后，继续洗涤 23ml。凝胶层析柱即可再生平衡，可再次使用注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面
10、时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，特别是收集伽马球蛋白时。步骤 操作（1）调节层析柱换冲液面经处理再生好的 DEAE 纤维素层析柱，取下其恒压储液瓶管塞。小心控制柱下端螺旋夹，使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面。柱下端用 10ml 刻度离心管收集液体，以便了解加样后液体的流出量。（2）加样品 将除除盐后收集的球蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上，调节
11、层析柱下端的螺旋夹使样品进入纤维素柱床，至液面降到纤维素柱床表面为止。（3）析层析 小心用 1ml 0.02mol/L PH 6.5 的醋酸铵缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样品液。（4）洗脱 待样品进入纤维素柱床内，继续用 0.02mol/L PH 6.5 的醋酸铵缓冲液流洗，。同时注意流出液量（5）检测及收集蛋白质流洗时，随时用 0.92mol/L 磺基水杨酸检查流出液中是否含蛋白质（方法同前）当有蛋白质出现时，立即连续收集三管，每管 10 滴，。此不被 DEAE 纤维素吸附的蛋白质即为纯化的 -球蛋白，取其中蛋白质浓度最高的一管留作鉴定用。4 清蛋白的纯化：过 DEAE 纤维素阴离子交换层析
12、柱步骤 操作（1）调节层析柱缓冲液面此时 DEAE 纤维素层析柱不必再生，可直接用于纯化清蛋白小心控制住下端螺旋夹，使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面，柱下端用 10ml 刻度离心管收集液体，以便了解加样后液体流出量（2）加样品 将除盐后收集的清蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上，调节层析柱下端的螺旋夹，使样品进入纤维素柱床，至液面降到纤维素柱床表面为止（3）洗层析柱将除盐的粗制清蛋白溶液上柱后，改到 0.06mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲液洗脱小心用 1ml 0.06mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样品液（4）洗脱 待样品进入纤维素柱床内，继续用 0.06
13、mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗。同时注意流出液量。流出约 6ml（其中含 -球蛋白及 -球蛋白）后，将柱上的缓冲液面降至与纤维素表面平齐。改用 0.3mol/L、pH6.5 NH 4AC 缓冲液洗脱（5）检测及收集蛋白质用 0.92mol/L（20%）磺基水杨酸检查流出液是否含有蛋白质（方法同前）。由于纯化的清蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，故肉眼可见一层浅黄色的成分被 0.3mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲液洗脱下来，大约改用 0.3mol/L NH4AC 缓冲液洗脱约 2.5ml 时，即可在流出液中试出有蛋白质出现，立即连续收集 2 管，每管 10 滴，此即为纯化的清
14、蛋白液，留作纯度鉴定用（6）纤维素层析住的再生与平衡用过的 DEAE 纤维素层析柱，应重新再生平衡先用约 6ml 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4AC 溶液流洗，再用0.02mol/L pH6.5 NH4AC 液约 10ml 流洗平衡即可注意：a.当层析柱的缓冲页面或样品页面刚好下降到纤维素膜表层时，不要是液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.使用时切勿将各时段所用的溶液浓度搞混。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。5 纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）步骤 操作
15、准备 电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲溶液，使其在同一水平 a，页面与支架距离 22.5cm，用三层滤纸或双层纱布搭桥薄膜准备：将醋酸纤维薄膜裁成 2cm 乘以 8cm 大小共四段，在薄膜一段 1.5cm 处用铅笔轻轻画上一条横线为点样线，末端用铅笔做记号。进入巴比妥溶液中直至浸润完全。用镊子青青取出，粗面朝上，平放在两层干滤纸中间，轻轻拭去多余的缓冲液。点样 薄膜片置于干净的玻璃或滤纸片上，粗面朝上，用玻片或载玻片一段的截面在盛有样品的直接沾取 23 微升待测品，让后将样品与薄膜点样先轻轻接触，均匀分布在点样线上，带样品渗入薄膜后移开，四种样品分别点样。电泳 将已
16、点好的样品薄膜放在铺有滤纸盐桥的电泳槽上，点样面朝下，点样端至阴极，轻轻拉平薄膜。平衡约 5min，使缓冲液渗透大道平衡。接好电路，调节电压开始电泳。待各个样品没有变化停止电泳，并轻轻取出。染色漂洗和鉴定将染色液倒入大培养皿中，电泳完毕后用镊子取出薄膜，直接浸入染色约 5min。后将薄膜取出，漂洗至背景无色，观察电泳情况得出结论。四、结果与讨论：结果：实验数据、现象、图谱； 讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。1.实验结果从电泳图谱中可以看出，清蛋白第一管和清蛋白第二管的蛋白质与血清的清蛋白电泳图谱几乎一致，可以确定管内的蛋白质为清蛋白，同理球蛋白管内的蛋白质为 -球蛋白。2.实验讨论1
17、) 血清电泳中个别电泳带的两条带之间界限不明显1 染色时，醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。2 染色时间控制不合适。因为时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均；3 透明时间控制不合适，如在透明液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。2) 第一管血清蛋白电泳带参差不齐1 薄膜表面吸干时吸的太干或吸的不完全。因为点样时应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果；2 点样不均匀。3) 第一管血清蛋白中含有少量杂质致使电泳图出现偏差。思考题1. 硫酸铵盐析一步,为什么是 0.8ml 血清加 0.8ml 饱和硫酸铵?
