分子诊断学试卷.docx

1、分子诊断学试卷 A 二、填空 （每空 0.5 分，共 15 分。请将答案填写在答题纸上） 1.从高温嗜热细菌中发现高温 DNA polymerase 后，使得 PCR 技术得以广泛应用，在高温下有活性的 DNApolymerase 有 、 、 、 。其中具有 3 -5外切活性的高温 DNA polymerase 有 和 。 2.黏粒 (cosmid)是质粒噬菌体杂合载体，它的复制子来自 、 cos 位点序列来自 ，最大的克隆片段达到 45kb。 3.感受态细胞 (Competent cells)是一种处于 _状态的细胞。一般通过 _来诱导大肠杆菌感受态的形成。 4.PCR 反应过程分为三个步骤

2、，即 ， 和 。 5. 细菌的移动基因存在着三种类型的转位因子包括 、 、 。 6.Klenow 酶在 情况下，呈现 DNA 聚合酶活性，在 情况下呈现外切酶活性。 7. 外源基因在原核细胞中表达，常用的启动子有 、 、 、 和 。 8. 在 LacZ 标记基因插入外源基因，经 IPTG 诱导，在 X-gal 培养基中显 色，为 性克隆，未插入基因的克隆显 色，为 性克隆。 9. 基因序列经碱基替代，缺失或插入后，可使遗传信息产生三种不同的后果，分别为 、 、 。 10.由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为 。 三、判断题 （错的打“”，对的打“”，每题 1 分，共 10

3、分。请将答案填在答题纸对应的题号下） 1. Maxam-Gilbert 化学降解法测序时，从测序胶上直接读出的序列是用于测序的模板的互补序列 。 2. 蛋白酶 K 可有效地降解内源蛋白，能快速水解细胞裂解物中的 DNA 酶和 RNA 酶，以利于完整 DNA 和 RNA 的分离。 3. 电泳时 EB 加在琼脂糖凝胶中一般会降低 DNA 在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率。 4. 提取 DNA 时，若用酚除蛋白质，需要用 Tris-HCl 对酚进行平衡 ,pH 达 7.8。 5. 基因组研究可以归纳成为构建 4 张相互关联的基因组图谱：遗传图、物理图、序列图和功能图。 6. DNA 连接酶是一种能催化二条

4、 DNA 链之间形成磷酸二酯键的酶，因此该酶既可修复基因序列中的缺口，也可修复裂口。 7. 质粒提取后，在琼脂糖电泳出现一条带时说明质粒提取纯度高，当为三条带时为纯度不高。 8. COS 位点， COS 质粒， COS 细胞它们均含有用于自身环化的 12 个碱基的互补粘性末端。 9. 入噬菌体的插入型载体只有一个单一限制酶切点，替换型载体有 2 个成对的限制性酶切点。 10. 原核细胞和真核细胞转录的 mRNA 均具有与 rRNA 结合的 SD 序列，以利于进行有效的转录。 四、选择题 （每题 1 分，共 15 分。请将最佳答案填在答题纸对应的题号 下） 1. 用于核酸分子杂交的探针不能是放射

5、性标记的 ( )。 A DNA B RNA C抗体 D寡核苷酸 2. cDNA 文库包括该种生物的 ( )。 A某些蛋白质的结构基因 B所有蛋白质的结构基因 C所有结构基因 D内含子和调控区 3. 关于碱解法分离质粒 DNA，下面哪一种说法不正确 ?( ) A溶液 I 的作用是悬浮菌体 B溶液的作用是使 DNA 变性 C溶液的作用是使 DNA 复性 D质粒 DNA 分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性 4. 有关 DNA 序列自动化测定的不正确叙述是（ ）。 A不再需要引物 B激光扫描分析代替人工读序 C基本原理与手工测序相同 D 用荧光代替了同位素标记 5. 在重组 DNA 技术中，不

6、常用到的酶是（ ）。 A限制性核酸内切酶 B DNA 聚合酶 C DNA 连接酶 D DNA 解链酶 6. 关于 cDNA 的最正确的说法是（ ）。 A以 mRNA 为模板合成的双链 DNA B同 mRNA 互补的单链 DNA C同 mRNA 互补的双链 DNA D以上都正确 7. 在分离 DNA 过程造成 DNA 分子断裂的因素很多，下列说法中哪一项是不正确的（ ）。 A核酸酶的降解 B化学降解 C保存液中未加一滴氯仿 D物理剪切 8. 下列哪一项不是 Southern blotting 的步骤（ ）。 A用限制酶消化 DNA B DNA 与载体的连接 C凝胶电泳分离 DNA 片段 D DN

7、A 片段转移到硝酸纤维膜上 9. 下列哪种克隆载体对外源 DNA 的装载量最大（ ）。 A粘粒 B酵母人工染色体 C质粒 D 噬菌体 10. 人工染色体载体必须具有的元件是（ ）。 A染色体端粒 B着丝粒 C自主复制序列 D以上三项全部 11. 噬菌体外包装目的基因片段的大小应为（ ）。 A.小于噬菌体 DNA 的 50% B. 小于噬菌体 DNA 的 75% C.大于噬菌体 DNA 的 105% D.为噬菌体 DNA 的 75% 105% 12.识别基因序列不同，但酶切后产生的粘性末端相同的一类酶为（ ）。 A.同工酶 B.同尾酶 C.同裂酶 D.同位酶 13.下列生物体的细胞基因组哪些会有

8、断裂基因？（ ） A.大肠杆菌 B.乙肝病毒 C.人 D.噬菌体 14. 真核细胞基因表达的特点为（ ）。 A.单顺反子 B.多顺反子 C.转录和转译连续进行 D .转录和转译在同一时空进行 15. pBR322 质粒作为基因克隆载体不具有下列何种调控元件（ ）。 A.Ampr 和 Tetr B.ori 复制子 C.LacZ 标记 D.多克隆位点 五、问答题 （共 36 分，请将答案填写在答题纸对应的题号下） 1. 真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？为什么？（ 5 分） 2. 质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？（ 6 分） 3. 真核表达

9、调控的顺式作用元件有哪些？其作用特点是什么？（ 8 分） 4. 基因工程疫苗研究开发应遵循的原则是什么？（ 8 分） 5. 有哪几种反义核苷酸基因失活疗法？简述其原理。（ 9 分） 答案 -试卷 A 一、名词解释 （每题 3 分，共 24 分。请将答案填写在答题纸上） 1. 分子诊断：是指通过检测基因的结构异常或其表达异常，对人体的健康状况和疾病做出诊断的 方法。 2. 实时定量 PCR(real-time PCR)： 7.实时 PCR：通过特定设计的 PCR 仪器来实时检测 PCR 扩增过程每一轮循环产物的累积数量，推算模板的起始浓度，这种工作方式就称为实时 PCR 3. 重叠基因：不同基因

10、的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因 4. 锌指结构：由两个半胱氨酸（ Cys）残基和两个组氨酸（ His）残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构 , 并以锌辅基敖合形成的环状结构作为活性单位 , 在指状突出区表面暴露的碱基及其极性氨基酸与 DNA 结合有关 5. 基因置换：是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。 6. 基因敲除：基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变的基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术。 7. 基因芯片：将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片（又称

11、 DNA 芯片、生物芯片）。 8. 蛋白质组学：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能 . 二、填空 （每空 0.5 分，共 15 分。请将答案填写在答题纸上） 1. Taq DNA 聚合酶 Tth DNA 聚合酶 Vent DNA 聚合酶 Pwo DNA 聚合酶 Pfu DNA 聚合酶 Pwo DNA聚合酶 Pfu DNA 聚合酶 2. 质粒 噬菌体 3. 容易接受外源 DNA 片段 CaCl2 法 4. 变性 退火 延伸 5. 插入序列 转位

12、子 噬菌体 Mu 和 D108 6. 有 dNTP 没有 dNTP 7. 乳糖启动子 Trp 启动子 Tac 启动子 噬菌体的 PL 和 PR 启动子 脂蛋白启动子 8. 白 阳性 蓝 阴 9. 同义突变 错义突变 无义突变 10. 蛋白质组 三、判断题 （错的打“”，对的打“”，每题 1 分，共 10 分。请将答案填在答题纸对应的题号下） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 四、选择题 （每题 1 分，共 15 分。请将最佳答案填在答题纸对应的题号下） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 答案 C A D A D A C B B D

13、 D B C A C 五、问答题 （共 36 分，请将答案填写在答题纸对应的题号下） 1. 真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？为什么？（ 5 分） 答：不能，因为原核细胞缺乏对真核基因中内含子的剪接功能和转录后加工系统。原核生物必须有相应的原核 RNA 聚合酶可识别原核细胞的启动子 , 以催化 RNA 的合成。 基因表达是以操纵子为单位，操纵子由数个相关的结构基因和调控功能的部位组成的。因此在构建原核表达载体时必须有 1 个强的原核启动子及其两侧的调控序列。 2. 质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？（ 6 分） 答：目的基因片断与载体由相

14、同的单一限制性核酸内切酶（如 EcoRI）消化酶切后 , 两者的两端均具有相同的粘性末端 , 称为单酶切点的粘性末端 , 又称全同源性粘性末端 高背景 载体经单一限制性核酸内切酶切割后 , 载体分子易于自我环化 , 既不利于目的基因的重组连接 , 大大降低阳性克隆效率 , 又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的 5-P 以抑制 DNA 的自我环化。在连接反应中 , 具有 5-P，的目的基因 DNA 片断可有效地与去磷酸化质粒 DNA 载体通过粘性末端发生互补连 接 , 尽管产生的重组 DNA 分子于连接点含有两个缺口的开环分子 ,尽管在转化时其

15、转化效率高于线性低于闭和环 , 但转化大肠杆菌后 ,在菌体内其缺口可获得修复。如第二章图 2-6 双向插入 经单一限制核酸内切酶（如 EcoRI）切割的目的基因和载体 , 因二者的粘性末端是相同的 , 因此在连接反应中 , 目的基因可发生双向插入 , 载体对目的基因表达是有方向的 , 而目的基因可双向与之相连 , 这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响 , 若以表达为目的 , 我们就要对插入的片段进行方向鉴定 , 因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的 , 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的 mRNA。若构建表达 DNA 重组体选用双酶切切割目的基

16、因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组 , 以便定向克隆。 3. 真核表达调控的顺式作用元件有哪些？其作用特点是什么？（ 8 分） 答：顺式作用元件为一些能与 DBP 结合的特定序列的 DNA 片段 , 决定转录起始位点和 RNA 聚合酶的转录效应 ,按功能可分为启动子、增强子、沉默子、衰减子和终止子等 DNA 序列片段。 启动子 真核基因启动子是基 因表达时与基因转录起始有关的 5端 DNA 序列 ,包括在 -30bp 区富含有 AT 的典型 TATA 盒（框）（ TATA box）和在 -70 -80bp 区域（在 TATA box 上游）启动元件。前者是引导 RNA 聚合酶在

17、正确起始位点转录 mRNA 所必需的 DNA 序列 , 即保证转录的精确起始。后者 UPE 是调节转录起始频率和提高转录效率的调控序列，后者的序列常为 GGTCAAT 和 GGGCCC 序列 , 称为 GC box, 它们经协同作用 ,以调控基因的转录效率。 启动子的转录效率因细胞而异，因此需要根据宿主细胞的类型选择不同的启动子，以便真核基因的高效表达。常用的启动子有 Rous 肉瘤病毒启动子 RSV 和巨细胞病毒的启动子 CMV。还有 SV40 早期启动子 , 腺病毒的晚期启动子。 增强子 增强子是使启动子的基因转录效率显著提高（增强转录活性）的一类顺式作用元件，其本身不具有启动子活性，是由

18、多个独立的，具有特征性的核苷酸序列所组成。其基本的核心组件常由 812bp 组成 , 以单拷贝或多拷贝串联的形式存在。增强子一般有以下特性：增强子能提高同一条 DNA 链上基因转录的速率 ;增 强子对同源或异源基因都有效 ; 增强子的位置可在基因 5上游、 3下游或内部 ; 无方向性 ,增强子从 5 3或是从 3 5均可对启动子发挥作用 ; 增强子可远离转录起始点 ; 增强子一般无基因特异性 , 对各种基因启动子均有作用 , 但具有组织或细胞特异性。 典型的增强子首先发现于 SV40 的病毒中 , 为 SV40 的早期基因增强子 , 约 200bp, 含 2 个 72bp 的重复序列 , 位于

19、早期启动子上游 , 增强子可促使病毒基因转录效率提高 100 倍，因此具有这一增强子的载体已得到了广泛的应用。近些年来，来自于 Rous 肉瘤病毒基因长末端重复序列和人类巨细胞病毒（ CMV）增强子也已被广泛用于真核细胞的基因表达。 增强子能增强启动子的转录能力，有效的增强子能促进转录达 10 倍或 100 倍以上 , 在某些情况下 , 表达产物可能具有细胞毒效应。因此，最好使用一种可被外界刺激信号诱导表达外源基因的诱导型启动子 ,诱导型启动子有热休克启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激和固醇类激素诱导的启动子，热休克启动子的诱导可通过提高细胞的培养 温度使启动子转录水平提高，重金属离子可有效地

20、促进金属硫蛋白启动子的转录活性。 RNA 剪接信号 多数高等的真核基因都含有内含子序列 , 在细胞核内转录产生的前体 mRNA 要经过剪接过程去掉内含子顺序后才成为成熟的 mRNA 分子。虽然许多基因的 cDNA 转入哺乳类动物细胞后 , 其表达不受有或无内含子的影响 , 但有些基因在真核细胞中表达需要有内含子的存在。一般来说，在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序列的剪接信号，以提供外源基因 cDNA 表达的需要。常用的内含子剪接序列有 SV40的小 t 抗原的内含子序列等。 负调控元件 沉默子和衰减子是抑制基因转录的 DNA 序列 , 称为负调控元件 , 它们与反式作用因子相互结合而

21、起作用。这些负调控元件不受距离和方向的限制，并可对异源基因表达起作用。 终止子和 polyA 信号 真核基因转录的确切终止信号和终止机制 , 目前尚不清楚 , 终止过程不是在 RNA 聚合酶指导下完成的 , 在不明机制下发生转录终止。现在已发现模板 DNA 分子的 3端有转录终止信号序列 , 称终止子。通常由转录产生的具有 polyA 尾的基因终止信号是在多聚腺苷酸化位点下游的一段长度为数百个碱基的 DNA 区域内的 G/T 簇 , 例 如在 SV40 中的 AGGTTTTTT 的 DNA 序列为终止转录调控元件。一般转录终止子为发夹结构的反向重复序列。现在基因工程表达载体上所使用的转录终止子

22、都是病毒基因或细胞基因的 3端的一段序列 , 其中也包括 3端不翻译区。如 SV40小 t抗原和 -球蛋白的转录终止片段常用于构建真核基因表达载体。 一般认为 polyA 的存在增加了 mRNA 分子的稳定性 ,使之能成功地进行翻译。准确而有效地进行多聚腺苷酸化需要两种序列：位于 polyA 位点下游的 GU 丰富区或 U 丰富区 ; 位于 polyA 位点上游的 11 30 个核苷酸处的一个由 6 个核苷酸组成的高度保守序列（ 5-AAUAAA） , 这些序列与转录后的 RNA 切割和加尾有关。最常用的 polyA 信号是用 SV40 的一段 237kb 的 BamHI-BcLI 酶切片段

23、, 它包含早期和晚期转录单位的切割和加 polyA信号 , 两套信号分别位于不同的 DNA链上 , 作用方向相反 , 它们对 mRNA的加工都同样有效。 在双启动子的表达载体中，启动子的转录方向为同向时，上游启动的转录由于会穿过下游启动子，这样就使得下游的转录受到极大的影响，造成下游转录水平的下降，但是如果在两个启动子间插入一个转录终止子后，上游启动 子对下游启动子的影响就被消除了，这样下游启动子的表达量会有明显提高。当两个启动转录方向相反时，基因表达可能会被转录形成的反义 RNA 所抑制 , 这时插入转录终止子将会消除这种抑制作用。 4. 基因工程疫苗研究开发应遵循的原则是什么？（ 8 分）

24、 答： (1)不能或难于培养的的病原体如乙型肝炎病毒 (HBV)，丙型肝炎病毒 (HCV)，戊型肝炎病毒 (HEV)，EB 病毒 (Epstein-Barr 病毒， EBV)，巨细胞病毒 (CMV)，人乳头瘤病毒 (HPV)，麻风杆菌，疾原虫、血吸虫等。 (2)有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体 ，前者如 1 型嗜人 T 淋巴细胞病毒 (HTLV-I)，人免疫缺损病毒 (HIV),单纯疱疹病毒 (HSV)，还有 EBV、 CMV、 HPV 等。后者如呼吸道合胞病毒 (RSV),登革热病毒 (DGV)，肾综合征出血热病毒 (HFRSV)； (3)常规疫苗免疫效果差，如霍乱和痢疾菌苗；或者反应大，

25、如百日咳和伤寒菌苗。 (4)能大大节约成本，简化免疫程序的多价疫苗，如以痘苗病毒，腺病毒，卡介苗或沙门氏菌为载体的多价活疫菌； 5. 有哪几种反义核苷酸基因失活疗法？简述其原理。（ 9 分） 答：（ 1）将特异的反义基因重组到表达载体上（病态载体或质粒），导入靶细胞中转录出反义 RNA，形成双链 RNA（ RNA/RNA 双链体），阻碍基因的翻译。（ 2）人工合成寡聚脱氧核糖核酸（ ODN）经过化学修饰导入细胞，与 mRNA 和 DNA 结合，形成 RNA/DNA 杂链或 DNA 核苷酸三聚体，影响基因的翻译或转录。（ 3）特异性的核酶，根据癌基因设计出特异的“锤头”或“发夹”结构，它能够催化

26、切割，降解异常表达基因的 mRNA 而影响基因的翻译。 分子诊断学试卷 B 二、选择题（每题 1 分，共 15 分 ; 请将答案填写在答题纸上 ） 1. 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是 ( )。 A.修复自身的遗传缺陷 B.促进自身的基因重组 C.强化自身的核酸代谢 D.提高自身的防御能力 2. 生物工程的下游技术是 ( )。 A.基因工程及分离工程 B. 蛋白质工程及发酵工程 C.基因工程及蛋白质工程 D.分离工程 及蛋白质工程 3. 基因工程操作常用的酶是 :(I 内切酶 II 连接酶 III 末端转移酶 IV 聚合酶 ( )。 A. I + II B. I + III +

27、IV C. II + III + IV D. I +II + IV + III 4. 限制性内切核酸酶的星活性是指 ( )。 A. 在非常规条件下，识别和切割序列也不发生变化的活性。 B. 活性大大提高 C. 切割速度大大加快 D.识别序列与原来的完全不同 5. 下列五个 DNA 片段中含有回文结构的是 ( )。 A. GAAACTGCTTTGAC B. GAAACTGGAAACTG C. GAAACTGGTCAAAG D. GAAACTGCAGTTTC 6. 关于 cDNA 的不正确的提法是 ( )。 A.同 mRNA 互补的单链 RNA B.同 mRNA 互补的含有内含子的 DNA C.以

28、 mRNA 为模板合成的双链 RNA D.以上都不正确 7. 下列有关连接反应的叙述，错误的是 ( )。 A. 连接反应的最佳温度为 37 B. 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10% C. 连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mM D. 连接酶通常应过量 2-5 倍 8. T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是 ( )。 A. 2 -OH 和 5 P B. 2 -OH 和 3 -P C. 3 -OH 和 5 P D. 5 -OH 和 3 -P 9. 载体的功能是 ( )。 A. 外源基因进入受体的搭载工具 B. 不能为外源基因

29、提供整合能力 C. 不能提供复制能力 D. 不能为外源基因提供表达能力 10. 黏性末端连接法，不仅操作方便，而且 ( )。 A.产生新切点 B.易于回收外源片段 C.载体不易环化 D.影响外源基因的表达 11. 下列哪种克隆载体对外源 DNA 的容载量最大 ? ( ) A.质粒 B.黏粒 C.酵母人工染色体 (YAC) D.噬菌体 12. 考斯质粒（ cosmid）是一种 ( )。 A.容量最大一种载体 B.由 -DNA 的 cos 区与一质粒重组而成的载体 C.是一种单链 DNA 环状载体 D.不能在受体细胞内复制，但可以表达 13. 13 ( )某一重组 DNA 的载体部分有两个 Bam

30、HI 酶切位点。用 BamHI 酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子，其长度总和与已知数据吻合，该重组分子插入片段上的 BamHI 酶切位点共有 ( )。 A.4 个 B. 3 个 C. 1 个 D. 2 个 14. 下列哪一种酶作用时需要引物 ? ( ) A.限制酶 B.末端转移酶 C.反转录酶 D. DNA 连接酶 15. 用下列方法进行重组体的筛选，只有 ( )说明外源基因进行了表达。 A.Southem 印迹杂交 B.Northem 印迹杂交 C.Western 印迹 D.原位菌落杂交 三、简答题（每题 5 分，共 25 分 ; 请将答案填写在答题纸上 ） 1. 什么是包涵体？ 2.

31、 什么是 -互补筛选？ 3. 简述酶切反应体系及反应条件？ 4. 核酸操作的基本技术有哪些？ 5. 基因工程诞生的理论基础是什么？ 四、论述题（每题 10 分，共 40 分 ; 请将答案填写在答题纸上 ） 1. 如何有效地提高外源基因的表达效率？ 2. 试述载体构建一般方法。 3. 试述 5 RACE 技术原理和方法 4. 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？ 答案 -试卷 B 一、名词解释（每题 2 分，共 20 分） 1. 转化： 严格地说是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体 DNA 分子的生命过程 2. 质粒不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系

32、中稳定地共存的现象。 3. cDNA 文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而成的克隆的集合。 4. RACE：是一种通过 PCR 进行 cDNA 末端快速克隆的技术，是以 mRNA 为模板反转录成 cDNA 第一链后用 PCR 技术扩增出某个特异位点到 3， 或 5， 端之间未知序列的方法。 5. 基因文库：通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物，组织，器官或细胞类型的所有 DNA 片段而构成的克隆集合体。 6. RT-PCR:先用逆转录酶作用于 mRNA，以寡聚 dT 为引物合成 cDNA 第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录 PCR

33、。 7. 载体：指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的运载工具，它的本质是 DNA 复制子。 8.S-D 序列：在大肠杆菌 mRNA 的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同 16S 核糖体 RNA 3，末端碱基互补的序列，该序列最初由 Shine 、 Dalgarno 发现，故后来命名为 Shine-Dalgarno 序列，简称 S-D 序列。 9. 穿梭质粒载体：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。 10.MCS：指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的 DNA 片段。 二、选择题（每题 1 分，共

34、15 分） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 答案 D A A D D C A C D C C B D C C 三、简答题（共 25 分，每题 5 分） 1. 什么是包涵体？ 答：重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象，这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。 2. 什么是 -互补筛选？ 答：质粒载体具有 -半乳糖苷酶基因（ lacZ），当外源 DNA 插入到它的 lacZ，可造成表达后的 -半乳糖苷酶失活，利

35、用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有 X-gal-IPTG 培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。有些大肠杆菌上带有 lacZ 基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。这种 lacZ 基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫互补。 3. 限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？ 答：酶的纯度。 DNA 样品的纯度。 DNA 的甲基化程度。 酶切反应的温度与时间。 DNA 分子的构型。 限制性核酸内切酶的反应缓冲液。 4. 核酸操作的基本技术有哪些？ 答：核酸提取与纯化核酸的检测与保存核

36、酸的凝胶电泳核酸分子杂交 5.基因工程诞生的理论基础是什么？ 答：是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。 理论上的三大发现： 证实了 DNA 是遗传物质 揭示了 DNA 分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理 遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定 技术上的三大发明： 限制核酸内切酶的发现与 DNA 切割 DNA 连接酶的发现与 DNA 片段的连接 基因工程载体的研究与应用 四、论述题（每题 10 分，共 40 分） 1. 如何有效地提高外源基因的表达效率？ 答：提高启动子强度 缩短启动子同克隆基因间距离 高效的翻译起始序列 高效的转录终止区 提高质粒拷贝数及稳定性 用以下方法

37、提高翻译水平：调整 SD 序列与 AUG 间的距离用点突变的方法改变某些碱基增加 mRNA 的稳定性的 减轻细胞的代谢负荷：诱导表达表达载体的诱导复制 提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：克隆一段原核序列，表达融合蛋白采用某种突变菌株表达分泌蛋白质 2. 试述载体构建一般方法。 答： A 目的基因分析（ 1） ORF 分析（ 2）酶切位点分析 B 载体选择与分析（ 1）多克隆位点分析（ 2）抗性标记分析（ 3）启动子与其他筛选标记分析 C 连接体系与连接时间确定 3. 试述 5 RACE 技术原理和方法答： PCR 用于扩增代表 mRNA 转录物某一单位点与其 3或 5末端之间区域的部分 cDN

38、A 称为快速扩增 cDNA 末端技术（ RACE）。如果已知 mRNA 的一片段链内短序列 ，据此或设计基因特异引物，用原先存在的 poly(A)尾（ 3末端）或附加的同聚尾（ 5末端）互补的序列做末端引物，就可以获得从未知末端直到已知区域的部分 cDNA 序列。为获得 5末端部分 cDNA 克隆需用基因特异引物，产物第一链产物，可用末端脱氧核苷酸转移酶及 dATP 加 poly(A)尾。通过 QT 引物和反转录使用的上游基因特异引物生成第二链 cDNA。 4. 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？ 答：优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子 机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。 缺点：在通常情况下，细菌的 RNA 聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。