1、培养基的制备与消毒灭菌 实验报告实验目的1.学习和掌握配制培养基（以牛肉膏蛋白胨培养基的配制为例）的一般方法和原理。2.了解消毒和灭菌的原理，掌握常用灭菌方法的操作步骤。实验原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对 PH 要求不一样雷菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的(嗜碱细菌和嗜
2、酸细菌例外)。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。高压蒸气灭菌是将持灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀继续加热，此时由于蒸气不能道出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于 100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应
3、用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和 NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而 NaCl 提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下 96时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下而垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在 40时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其 PH
4、调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0 gNaCl 5.0g水 1000mlpH 7.47.6实验仪器与药品1.溶液或试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1molL NaOH、1molL HCl。2.仪器或其他用具：试管、三角瓶、1000ml 烧杯（或 1000ml 刻度搪瓷杯） 、量筒、玻棒、培养基分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH 试纸（pH 5.5-9.0） 、普通棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布等。实验步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的制备1.称量（假定配制 1000ml 培养基）按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏
5、、蛋白胨、NaCl 放入烧杯（或 1000ml 刻度搪瓷杯）中牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放人水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。2.溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约 700ml） ，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积（1000ml） ；如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。3.调 pH在未调 pH 前，先用精密 pH 试纸测量培养基的原始 pH，如果偏酸用滴管向培养基中逐滴加入1molLNaO
6、H，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸测其 PH，直至 pH 达 7.4-7.6。反之，用 1molLHCl 进行调节。4.过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。可以省去(本实验勿需过滤)。5.分装液体分装分装高度以试管高度的 14 左右为宜。分装三角瓶的虽则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。固体分装分装试管，其装量不超过管高的 15，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。半固体分装一般以试管高度的 13 为
7、宜，灭菌后垂直待凝。6.加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅胶塞、金属或高温塑料试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内面造成污染，并保证有良好的通气性能(棉塞制作方法附本实验后面)。7.包扎加塞后，将全部试管放入铁丝筐或用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、配制日期。8.灭菌将上述培养基以 0.103MPa，l21，20min 高压蒸气灭菌。9.摆斜面将灭菌的试管培养基冷至 50左右(以防斜面上冷凝
8、水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜l0.无菌检查将灭菌培养基放入 37的恒温箱中培养 24-48h以捡查灭菌是否彻底。注意事项1.蛋白胨很容易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称量时严防药品混杂一把牛角匙用于一种药品或称取一种药品后，洗净擦干再称职另一药品瓶盖也不要盖错。2.在琼脂溶化过程中应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦，制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。3.对于有些要求 PH 较精确的微生物，其 PH 的调节可用酸度计进行(使用方法、可参考有关说明书)。p
9、H 不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制 pH 低的琼脂培养基时若预先记好 PH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性 pH 条件下灭菌，再调整 pH。4.分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免沾污面塞而引起污染。（二）高压蒸汽灭菌法步骤1.加水使用前在锅内加入适量的水，加水不可过少，以防将灭菌锅烧干，引起炸裂事故。加水过多有可能引起灭菌物积水。水面与三角架相平为宜2.装料将灭菌物品放在灭菌桶中，不要装得过满。3.加盖盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺旋，打开排气阀。4.加热排气加热后水蒸气与空气一起从排气
10、孔排出，待锅内沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时，排出的气流很强并有嘘声时，维持 23min 以排除冷空气。如灭菌物品较大或不易透气，应适当延长排气时间，务必使空气充分排除，然后将排气阀关闭。5.加压将排气阀关闭6.保压当压力升至 0.1MPa 时，温度达 121，此时应注意观察，控制热源。保持压力稳定，维持 20-30min后，切断热源。7.自然降压当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至 100以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖，取出灭菌物。注意：切勿在锅内压力尚在“0”点以上，温度也在 100以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。压力降到“0”时，方可打开排气阀。8.保养 灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。9.培养基无菌检查五、关键步骤及注意事项1.要严格按配方配制。2.调 pH 不要过头。3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70C 以下放物、取物。4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告报告题目 培养基的制备与消毒灭菌 实验报告姓 名 学 号 专 业 批次/层次 指导教师 学习中心
