1、 MicroRNA 对上皮 -间质转化的影响 MicroRNA plays an important role in epithelial - mesenchymal transition 【摘要】 上皮 -间质转化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在一系列影响因素的作用下转化为具有间质表型的细胞。研究显示， EMT与肿瘤的侵袭和转移密切相关。 MicroRNA(miRNA)是 一类具有基因转录后调控作用的非编码小 RNA也参与了 EMT过程，本文就 miRNA对 EMT的影响做一综述。 【关键词】 上皮 -间质转化，小 RNA, 肿瘤
2、 【引言】 1. 上皮间质转化的介绍 现如今，绝大多数肿瘤造成的死亡并不是由于原发性肿瘤引起，而是由癌细胞的转移造成。在上皮细胞的转移研究中，上皮 -间质转型（ EMT）成为研究的热点。上皮 间质转型是是指细胞在受到物理 、 化学等因素的作用下，由有极性分布 、 静止的上皮细胞转化为无极性分布 、 运动活跃的间质样细胞的过程 。这个 概念最初是在 1982年被提出的 .Greenburg和 Hay【 1】发现晶状体上皮细胞可暂时失去细胞极性 , 在胶原凝胶中转化为间质细胞样形态 , 获得了移行能力 , 从而提出了 EMT这一说法 . 随后的大量研究发现 , EMT不仅在多细胞生物胚胎发育过程中
3、起作用 , 而且在器官纤维化 (如肝脏纤维化、肾脏纤维化等 )以及肿瘤侵袭和转移中也起着重要作用 。 2002 年， Theiry和 Weinberg提出恶性肿瘤细胞发生转移前会发生上皮 间质转化以获得间质细胞所具有的运动和侵袭能力，从而进入血道 、 淋巴道进行远处转移。 EMT是一个复杂的具有多种调节机制的动态过程 2 。其分子变化特征如下：上皮细胞黏附相关分子 ( 如 E 钙粘蛋白 ) 、 上调间质细胞特征相关分子 ( 如 N 钙粘蛋白 ) 及表达各种细胞外基质 ( extra cellular matrix， ECM) 相关蛋白表达下调。引起的细胞改变包括 : 细胞之间黏附的丧失，细胞所
4、附着基底膜和 ECM 的破坏以及细胞骨架重建导致细胞迁移力和运动能力增强 。 此过程受多因素调控，在诱导 EMT 形成的模型中，信号分子与细胞膜表面特异性受体结合，进而通过细胞内各条不同的信号传导途径活化，激活核 内转录因子，从而使细胞表型发生不同程度的转化。 EMT涉及的信号通路主要有 3 ： 转化生长因子 1( transforming growth factor beta 1， TGF 1) 信号传导通路 、 低氧诱导因子 ( Hypoxic induced factor， HIF) 信号通路 、 GSK 3 磷酸化信号通路 、 Wnt / catenin 信号通路等。目前对 EMT的研
5、究主要涉及上述通路以及生长因子受体（ hepatocyte growth factor receptor， HGFR）、表皮生长因子受体 (epidermal growthfactor receptor,EFGR)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)等多种蛋白受体， ZEB1、 ZEB2、TWIST等多个转录因子。有关 EMT的通路示意图如图 1示。 根据上图将具体的一些重要的通路和影响因子作一详细介绍。 多年的研究结果提示：血清 TGF 1水平不仅与肿瘤恶性程度呈正相关，而且也是有效的 EMT诱发因素。核转录因子 kapp
6、aB (nuclearfactor kappaB， NF-B)是 TGF通路诱导 EMT发生的重要分子，同样可以促进 Snail转录因子的表达 ， 从而下调 E-黏附蛋白的表达水平。 Wnt通路也是 EMT中 1条重要的信号通路， -连蛋白是 Wnt信号通路中的关键蛋白，其通过介导与 E-黏附蛋白间的相互作用参与细胞间的黏附。 -连蛋白磷酸化破坏了 E-黏附蛋白 / -连蛋白复合物的结构，导致细胞黏附力下降，使肿瘤细胞浸润、转移的能力增强。 磷脂酰肌醇 3激酶 (phosphatidy Iinositol-3kinase， PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路中 PI3K的作用是使磷脂酰肌醇发
7、 生磷酸化，产生第二信使进入细胞内进行信号转导。 PI3K有 2种激活方式，一种是通过 Ras和 p110直接结合，导致 PI3K的活化；而另一种则是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用，引起构象改变而被激活。 AKT是 PI3K信号转导通路的下游信号，活化的 AKT可通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移。 Ras/MAPK通路受体酪氨酸激酶是一类具有受体酪氨酸激酶活性的膜受体， 是小 GTP结合蛋白超家族成员。 MAPK主要参与细胞的增殖、分泌以及神经元分化等生物反应的调节。丝氨酸 /苏氨酸酶 Raf信号作为 Ras的效应物，其削弱
8、TGF的生长抑制和诱导凋亡作用，强化 TGF的致侵袭效应，从而诱导 MDCK细胞发生 EMT。 目前研究较多较成熟的信号通路下游有关 EMT的转录因子主要是Snail、 Slug、 SIP1及 Twist等。这类 DNA结合蛋白可以通过同 SIP1竞争性结合 E-黏附蛋白基因启动子部位的 E-box连接序列，直接下调 E-黏附蛋白及上调间质来源的波形蛋白表达，从而引起 EMT。 Twist还能直接增强 Snail的表达促使肿瘤细胞 发生 EMT。 而 miRNA与 EMT关系的研究主要集中在 TGF-途径和某些因子，还有很大的空间进一步研究。 2有关 microRNA的介绍 20 1993 年
9、， Lee 等首先在秀丽新小杆线虫发现 MicroRNA(简称 miRNA) 家族的第一个成员 lin 4。 随后，研究者陆续在多个生物物种中鉴别出上万种 miRNAs。 小 RNA的长度约为 22 个核苷酸，广泛存在于真核生物中，参与调节细胞代谢 、 增殖 、 凋亡 、 分化和发育 。 miRNA 的广泛存在与进化保守性也暗示着它在生命活动中必不可少的调节作用，目前已鉴定的人类miRNA 约 700 余种，调节人体内三分之一 mRNA 的表达 。 近年的研究表明其与人类肿瘤的发生和发展关系密切 4 。 在细胞核内，编码 miRNA 的基因在 RNA 内切酶的作用下合成前体 miRNA，随后转
10、运出细胞核，在细胞质内被 Dicer 剪切成 21 25 个核苷酸长度的双链 RNA。 双链 RNA中的一条单链会与 RNA 诱导的沉默复合体结合，另一条链发生降解 。miRNA 参与基因调控的主要方式有两种 : miRNA和靶 mRNA 完全互补时将促进其降解 ; miRNA 和靶 mRNA不完全互补时则抑制其翻译 。 由此可见 , miRNA通过诱导靶 mRNA降解或抑制靶 mRNA翻译在转录后水平调控基因表达 , 扮演着促癌或抑癌形成的双重角色 , 同时也参与到疾病的进展以及肿瘤 EMT过程的各个环节 ,显示了其作为诊断、预后标记物以及肿瘤治疗新靶向的可能性 . miRNA作为一个大家族
11、，不同的 miRNA对 EMT的作用并不相同，有些促进细胞内皮表型，抑止癌细胞的侵袭，有些促进细胞的间质表型，达到增强细胞转移的能力的能力，从而使转移灶形成，加重癌症。 内皮表型 EMT间质表型 miRNA表达水平 图 2，概括描述 miRNA对于细胞内皮表型（左）或间质表型（有）起重要作用 3对于 EMT过程起促进作用的 miRNA 3.1 起负性调节的 miRNA 18 19 miR-200 5 家族包括 miR-2f10a、 miR-200b、 miR-2c、 41及 miR-429，由于其位于不同的染色体可分为两个基因簇： miR-200b、 miR-200a、 miR-429和 mi
12、R-200c 14 、 miR-141，分别定位于染色体 1p36 33和 12p13 31。由于miR-200b、 miR-200c、 miR-429具有相同的核心序列“ AAUACU”， miR-200a、miR 141有共同核心序列“ AACACU”，又可在功能方面分为两个子家族。预测同一家族中的成员可能具有相似的靶基因谱，并可能参与相同或相关的生理过程。目前 miR-200在 EMT中的作用机制研究较为清楚的，是 miR-200 6 直接作用于 E-cad转录抑制因子 zEBl、 2及 EMT激活剂转化生长因子 B，进而调节 EMT相关基因如 E-cad、紧密连接蛋白 Z03、间隙连接
13、蛋白和斑菲素蛋白等的表达。 ZEBl也可直接抑制 miR-200的转录 17 ，并强烈激活癌细胞上皮分化，促进 EMT和肿瘤的侵袭。 miR-200和 ZEBl相互抑制形成一个互反馈回路 .在乳腺癌中 yndyak 等发现， miR 200b 和 miR 200c 可通过靶向调控 E 钙粘蛋白的转录抑制因子 :ZEB1、 ZEB2 来上调 E 钙粘蛋白，阻止肿瘤进展的关键过程 EMT。 在具有间质表型的乳腺癌细胞 MDA MB 231 和乳腺导管癌细胞 BT 549 中， miR 200 家族介导的 E 钙粘蛋白转录上调与 ZEB1 的转录抑制直接相关，与 E 钙粘蛋白启动子中的组蛋白 H3
14、乙酰化增加间接相关 。 Eades 等通过检测正常乳腺上皮细胞中TGF 介导的转化模型，证明 III 类组蛋白脱乙酰酶沉默信息调节子 1 ( silent information egulator 1， SIRT1) 在 EMT 过程中过表达，而 miR 200a 7 的表观基因沉默与 SIRT1 的过表达相关，此外，还在乳腺癌病人样本中观察到 SIRT1 过表达与 miR 200a 下降相关，说明 miR 200a 以 SIRT1 为靶基因调节 SIRT1 转录进而影响 EMT 过程 。 Moes 等发现， MCF7 乳腺癌细胞 Snai1 介导的 EMT 过程中， miR 203 和 mi
15、R 200 家族成员都以一种及时的相关方式被抑制，重要的是 miR 203 抑制内源性Snai1 组成一个双阴性 miR 203 / Snai1 反馈回路，将这个新的 miR 203 / Snai1 回路与已知的 miR200 /ZEB 回路集合到一起构成了 EMT 核心网络 。在卵巢癌中，当 miR-200a在 CD133/1+细胞中过表达， ZEB2的 mRNA和蛋白质水平都会表达下降，导致 E-cadherin表达上调，从而可以抑制 EMT的过程，继而抑制癌细胞的转移和扩散。通过 western blot和免疫荧光可以直接证明 miR-200a作用靶点就是 ZEB2。 在高转移胃癌细胞系
16、和转移组织中 miR 7 显著下调，功能获得和功能缺失实验以及体内转移实验都证实 miR 7 与胃癌的侵袭和转移有关 。miR 7 通过调控靶基因胰岛素样生长因子 1 受体 ( IGF1R) ，抑制Snail，增加 E 钙粘蛋白表达并部分逆转 EMT，从而发挥抗转移作用。转录共抑制因子羧基端绑定蛋白 1( Carboxyl terminal binding rotein 1， CtBP1) 可抑制多种抑癌基因表达， Deng等发现在黑色素瘤细胞系中 miR 137 的表达与 CtBP1水平成负相关，靶扫描推测 miR 137 的结合位点在 CtBP1的 3 UTR，其表达增加 CtBP1 的下
17、游效应器如 E 钙粘蛋白和 Bax，研究提示 miR 137 可能是通过直接靶向 CtBP1 来抑制 EMT 过程的 。 食管癌方面， Matsushima 等证实 miR 205 可通过靶向 ZEB2 来抑制 EMT，Western Blot 结果显示 : 敲除 miR 205 后，食管鳞癌细胞中 ZEB2 表达大幅度增高，同时伴随 E 钙粘蛋白的减少 。 在头颈部鳞癌领域， Liu 等发现 miR 138 通过 3 种不同的方式调节 EMT: 直接靶向波形蛋白mRNA，在修饰水平控制该蛋白表达 ; 靶向 ZEB2，调节 E 钙粘蛋白的转录活性 ; 靶向表观基因调节因子 EZH2( enha
18、ncer of zeste homologue 2) ，调整它在下游基因的沉默效应 。 P53/miR-34轴可以调节 Snail依赖的 EMT过程。在 P53表达的野生型细胞中， Snail依赖的 EMT在多种肿瘤细胞中表现，如 结肠癌，乳腺癌，和肺癌细胞等，但是在这些细胞中 miR-34表达下调。 miR-34 12 直接作用在 Snail高度保守的 3 非编码区，从而抑制 Snail的活性。 miR-34还可以作用于Snail的重要调控分子，包括 -连环蛋白 , LEF1, and Axin2.最终达到抑制 EMT的结果。 在多种癌细胞中发现 miR-138下调，包括 头部和颈部鳞状细胞
19、癌，之前实验证明， miR- 138下调与间充质样细胞形态和增强细胞迁移和侵袭相关。实验证实下调的 miR -138的诱导变化伴随着 E-cad的显着下降（ E-cadherin蛋白），表达增强 VIM（波形蛋白）表达， EMT。我们确定了 miR -138的靶基因数量与 EMT有关，包括 VIM ， ZEB2 ， EZH2 。用荧光素酶报告质粒可以证明 miR -138直接作用于波形蛋白的 mRNA，ZEB2 ， EZH2基因， miR -138的调节 EMT通过三个不同的途径： （ 1）直接调节波形蛋白的 mRNA，控制波形蛋白的在转录后表达水平， （ 2）作用于转录抑制因子（ ZEB2
20、） ，这反过来又调节 E-cad的基因的转录活性，（ 3）调节 EZH2 ，这反过来又调节其上下游基因，包括 E-cad的基因沉默等 。 3.2 对 EMT起正性调节作用的 miRNA 在人乳腺癌上皮细胞中， MIR9的异位表达会导致 EMT 8 .位于边缘的表达MIR9的肿瘤细胞具有间质细胞的标志物，如波形蛋白。少数位于瘤内区的少数细胞波形蛋白表达呈阳性。这可以证明，在肿瘤微环境中， MIR9可以诱导 EMT信号通路。在肝癌细胞中， MIR9高表达可以抑制肿瘤细胞的转移，MIR9直接作用于 KLF17的 30UTR区域，而 KLF作为 EMT的转录因子，调节EMT相关基因（ ZO -1 ，波
21、形蛋白和纤维连接蛋白）的启动。所以 MIR9抑制 EMT是通过直接抑制 KLF17实现的。在炎症环境中，由于 IL/6激活 STAT3通路，促使 MIR21高表达，导致 EMT.在多种肿瘤细胞中， MIR21 15 表达都会上调，并通过 EMT环节使癌细胞转移， MIR21的启动序列包括 E-BOX序列，作为 Zeb1的结合位点，当 Zebi结合后，会诱发 MIR21的转录，并抑制BMP蛋白诱导的对 EMT的抑制作用 16 。 TGFb是诱导 EMT的重要因素，大量实验证明， mir-155 13 的表达可以改变 TGFb诱导的 EMT。在给予 TGFb的实验组，主要是通过激活通路下游的 SM
22、AD4而使 mir-155上调。但是 mir-155本身不足以引起 EMT的全部表型。但它确实破坏了细胞的极性以及细胞的连接，当 mir-155的敲除会阻止TGFb诱导的 E-cadherin的下调，或是细胞的转移。更为重要的是 mir-155在间质表型的细胞中主要的靶点是 RhoA，它是维持细胞极性以及细胞连接的关键物质。当 mir-155被敲除时，可以直接抑制 TGFb诱导的 RhoA的下调。从而证明 mir-155对 EMT有促进作用。 据研究，在具有间质细胞表型的 RasXT细胞中，当 mir-29a高表达会抑制锌指蛋白 -36,（ TTP）， TTP和致癌基因 RAS信号通路协同降解
23、信使 RNA，和 mRNA的富含 AU的 3端结合，会造成 EMT以及肿瘤的转移。在乳腺上皮细胞中，上调 mir-29a，下调 TTP，会改变上皮细胞以及间质细胞的标志物，如， E-cadherin上调，而波形蛋白的表达会下调。细胞的极性和细胞之间的链接降低，造成 EMT. 在乳腺癌中，过表达的 mir-221/222会诱导 EMT的产生，它主要作用在GATA家族转录阻遏基因 TRPS1的 3非编码区。对于 mir-221/222诱导 EMT的完整通路目前还不清楚。但是对于 mir-221/222的直接作用靶点脂联素受体进行研究分析，当敲除脂联素受体之后，会激活 NF-kB和 IL-6/STA
24、T3通路，以促进肿瘤的转移扩散，还会造成 EMT.所以 mir-221/222与脂联素受体值得我们进一步研究分析。 【结论与展望】 综上所述， miRNA在上皮间质转型中发挥着重要的作用，这种作用在不同的 miRNA家族中表现不同，机制各异。 miRNA 作为转录后调控网络中关键的调控因子，与肿瘤 EMT 相关基因表达之间的关系十分密切，深入研究miRNA 与肿瘤 EMT 之间的关系及机制，有利于寻找逆转 EMT 过程的方法及治疗靶点，并将对肿瘤的诊断 、 治疗和预后评价等产生重大的影响 。 现有的生物分子技术已证实了一些 miRNA,但仍有很多的 miRNA未被发现， miRNA对肿瘤转移的
25、作用也只发现了一小部分，尚有很大的领域有待进一步研究。而且目前对 miRNA在肿瘤转移中作用的研究还处在理论水平，对其作用机制的研究尚处于很初级的阶段。各种肿瘤转移中 miRNA表达谱不同，特异表达 miRNA尚需确立；对其靶基因尚需验证； miRNA的调控和被调控通路尚需进一步的研究。 这需要我们更进一步研究 miRNA对肿瘤转移的作用，筛选 miRNA标志物，发展 miRNA 基因芯片技术等，以 miRNA与肿瘤的关系作为基石，将 miRNA发展成为肿瘤转移的诊断、治疗以及预后评估的重要手段。 【参考文献】 1 王宏刚 , 黄晓丹 , 季国忠 . EMT 的信号通路及 microRNA 在
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