1、CRISPR-Cas9一种新型基因编辑方法又 称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。方法包括：锌指核酸酶（ Zinc-finger nuclease， ZFN）技术转录激活因子样效应物核酸酶（ Transcription activator-like effector nuclease， TALEN）技术 Cas9/gRNA 系统 (CRISPR-cas9技术 )基因组编辑技术Cell 2014 157,1262-1278 Figure2B不论 是 TALEN技术还是 ZFN技术，其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋白模块的
2、合成 ,将蛋白模块与 限制性内切酶 (Fok ) 的 DNA切割域融合而 得到。由蛋白特异结合域 定位， DNA切割域 剪切 。锌指核酸酶（ ZFN）转录激活因子样效应物核酸酶（ TALEN）技术Cell 2014 157,1262-1278 Figure2ACRISPR-Cas9 技术 原理：规律性重复短回文序列簇（ clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPRs） CRISPR-Cas系统是 细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免疫防御机制，研究者根据 CRISPR-Cas 系统的特性对此系统进行
3、改造产生了第 3 代人工核酸内切酶技术 CRISPR-Cas9技术。该技术通过 小片段的 RNA 介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过 Cas酶对核酸进行酶切、 降解。 CRISPR-Cas9 技术是 一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编码工具。Cell 2014 157,1262-1278 Figure4CRISPR-Cas9 技术从已知的序列中通 过 PAM 进 行定位 寻 找合适的靶位点并合成 gRNA构建 gRNA 与 /Cas9 重 组质 粒。对 重 组质 粒 进 行活性 检测 ，敲除活性的 计 算挑 选 活性 较 高的敲除 质 粒 导 入培养的 细 胞或者生物体内 进 行基因
4、 组 定点 编辑 操作利用 测 序、 RFLP 等方法 检测 基因 组 定点修 饰结 果 sgRNA 的设计 选择 PAM（ NGG） 5端的 一段碱基序 列 20nt作为 原间隔序列，即敲除的靶位点 。 (PAM， Protospacer adjacent motifs 原 间隔序列临近 基序。一般形式为 NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的 DNA 序列中 )原则 ： 选择 的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。 优先选择 DSB 位点的侧翼存在 重复序列（如果 DSB 的侧翼存在重复序列，在进行非同源末端重组时能
5、够精确的介导断裂位点碱基的缺失）。 PAM 的 5端 尽量存在酶切位点 。（有利于后期的活性检测）构建重组质粒构建方案 ： 1. 一是将 gRNA 与 Cas9 连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载体中携带荧光报告基因（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于药物筛选） 。2. 二是将 gRNA与 Cas9 分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同的荧光报告基因或抗性 基因载体选择：慢病毒载体 以 HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基因治疗载体。区别于腺病毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的传代表达。gRNA的活性检测限制性内切酶法当 Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在
6、限制性内切酶切位点时，如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，这个位点将可能被破坏，而不能被 内切酶酶切。可采用电泳的方法估计突变效率， 以突变效率的高低来衡量sgRNA 的活性。非配对内切酶法T7 核 酸 内 切 酶 I（ T7 endonuclease I， T7E1） 能够识别不完全配对 DNA 并对其进行切割，如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，将基因组DNA 做 PCR，将相对应的 PCR 产物与野生型 DNA的 PCR 产物等量混合，并退火杂交，将产生非配对 DNA 片段，将能被非配对内切酶 T7E1 剪切。用电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量 sgRNA 的活
7、性。SSA 活性检测一个终止子插入 luciferase（ GFP）的编码区中央， luciferase（ GFP）就会失去活性。为检测 Cas9/sgRNA 剪切活性，将一个 Cas9/sgRNA的靶点位置序列插在终止子后。在 Cas9/ sgRNA 的作用下，靶点位置产生 DSB，细胞通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的 luciferase。通过与对照组的比值变化就可反应 Cas9/sgRNA 剪切的活性水平。降低 sgRNA/Cas9脱靶率的方法Cas9的两个内切酶活性域为 RuvC和 HNH,两个亚基分别负责对一条DNA单链的切割。任一亚基的失活都将形成 DNA单链断裂（
8、nicked DNA）。当结合于两条互补的 DNA 链上相邻位置的一对 sgRNA 同 时引 导Cas9 D10A 识别并切割靶位点时才能造成 DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了 Cas9-sgRNA 技术的特异性。Cell 2014 157,1262-1278 Figure6A,B重组质粒导入细胞 /生物体C、将编码 Cas9和 sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。D、将纯化的 Cas9和体外表达的 sgRNA显微注射至受精卵，快速得到转基因动物模型。E、将编码 CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组织或细胞，完成特定时间，组织的基因编辑。Cell 2014 157,1262-1278 Figure6C,D,E
