1、第六章第六章染色体显微操作染色体显微操作染色体微分析技术包括： 染色体显微切割、分离； PCR体外扩增；微克隆技术，染色体或特异区扩增产物间的 Southern杂交及 特异 DNA片段的 FISH定位 。该项技术是近十多年来随分子生物学技术发展而诞生的一项生物高新技术，它既有细胞生物学的可视性，又有分子生物学的先进性， 在染色体结构、基因组和比较基因组学、基因克隆、物理图谱构建等方面具有广泛的应用前景。 显微切割技术显微切割技术 是在显微状态或显微镜直是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织（组织 ,细胞群，细胞，细胞内组分或染细胞群，细
2、胞，细胞内组分或染色体区带等）色体区带等） 进行切割分离并收集用于进行切割分离并收集用于后续研究的技术。后续研究的技术。 显微切割技术实际上属于显微切割技术实际上属于 在微观领域对在微观领域对研究材料的分离收集技术研究材料的分离收集技术 ，因此应用此，因此应用此技术往往是许多要深入的研究工作中起技术往往是许多要深入的研究工作中起始的重要一步。始的重要一步。 显微切割的特点显微切割的特点 一是一是 “ 细微细微 ” ， 显微切割的对象可以达到显微切割的对象可以达到 微米微米级级 ，显微切割的精度可以达到，显微切割的精度可以达到 毫微米级毫微米级 ，因此，因此利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和
3、染利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和染色体特异区带这样细微的对象；色体特异区带这样细微的对象； 二是二是 “ 原位原位 ” ， 利用显微切割技术是在组织细利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。清楚，所研究对象的历史背景明确。 三是三是 “ 同质同质 ” ， 显微切割技术可以保证所取材显微切割技术可以保证所取材料一定层次上的同质性。料一定层次上的同质性。 四是四是 “ 结合结合 ” ， 显微切割技术可以与多种分子显微切割技术可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。生物学、免疫学及病理
4、学技术结合使用。 显微切割的结合技术显微切割的结合技术 能与多种能与多种 分子生物学、免疫学、遗传学及病理学分子生物学、免疫学、遗传学及病理学 技术技术结合应用，使显微切割技术显示出蓬勃的生命力。结合应用，使显微切割技术显示出蓬勃的生命力。 根据研究的需要可在显微切割前应用根据研究的需要可在显微切割前应用 组织化学、免疫组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位 PCR、 FISH、组织特染、组织特染 等方法对需要切割的组织内成分进行标记等方法对需要切割的组织内成分进行标记。 显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、显微切割后获得的材料可以用于提
5、取蛋白质、 DNA和和RNA等用于等用于 Western Blot、 Southern Blot、 Northern Blot、 PCR等蛋白质和核酸的相关分析。等蛋白质和核酸的相关分析。 显微切割的影响因素显微切割的影响因素 最终结果的因素多种多样。最终结果的因素多种多样。 在实验过程中把握一个原则在实验过程中把握一个原则 ,即一切与显即一切与显微切割结合的技术中影响因素应同时列微切割结合的技术中影响因素应同时列为显微切割实验最终结果的影响因素，为显微切割实验最终结果的影响因素，在实验的过程中予以考虑。在实验的过程中予以考虑。 与不同的方法结合决定了需要对显微切与不同的方法结合决定了需要对显
6、微切割的材料进行不同的处理。割的材料进行不同的处理。染色体显微切割技术出现于 20世纪 80年代。Scalenghe等（ 1981）首次报道了应用特殊玻璃针对果蝇唾液腺染色体进行切割、分离和显微克隆。 因为当时尚没有发明 PCR技术，需分离数百条染色体才可获得足够数量的 DNA。PCR技术发明之后， Ldecke等（ 1989）将 PCR技术应用到染色体显微切割和克隆中，仅用少量切割片段就获得了足够数量的 DNA。自 1989年以来，染色体的显微切割技术的研究成果主要是人类染色体区带特异探针池的构建，采用玻璃针法已相继构建了一系列人类染色体区带探针池。时至今日，植物染色体分离技术也已经发展成熟
7、，并成为构建染色体特异区段 DNA探针池最为有效和直接的技术手段，例如， 应用显微切割技术可以获得长度为 1 3Mb的 DNA片段，相当于水稻基因组遗传图谱上1 3cM。 在理论上，遗传标记之间 1cM的距离已连锁非常紧密。因此，应用染色体显微切割和分离技术建立特定染色体区段的 DNA文库，已成为筛选与基因紧密连锁的分子标记和基因克隆的有效方法之一。染色体显微切割的方法主要有 5种： 流式细胞分类器法、微细玻璃针法（手工操作法）、激光切割法、玻璃针 -激光法和激光捕获微分离法。此外， 目前开始尝试使用微操作机器人系统。1、激光切割法、激光切割法此法与手工操作法的主要差别在于：此法与手工操作法的
8、主要差别在于： 用激光束代用激光束代替玻璃针，替玻璃针， 将染色体标本上不需要的片段剔除，将染色体标本上不需要的片段剔除，然后将剩余染色体片段消化、扩增。然后将剩余染色体片段消化、扩增。 Fukui等利等利用此法成功地切割了植物染色体片段，但是该方用此法成功地切割了植物染色体片段，但是该方法对设备要求较高法对设备要求较高 ，激光切割区域对，激光切割区域对 DNA分子也分子也有损伤。有损伤。2、流式细胞分类器法：、流式细胞分类器法： 流式细胞分类技术分析和分选染色体是分子生流式细胞分类技术分析和分选染色体是分子生物学和遗传学研究的一个非常有效的方法。物学和遗传学研究的一个非常有效的方法。 1983年至年至 1986年，美国的两个实验室用流式细年，美国的两个实验室用流式细胞分类器和分子生物学技术建立了人类胞分类器和分子生物学技术建立了人类 24种染种染色体特异性的基因文库。也有学者利用此项技色体特异性的基因文库。也有学者利用此项技术分离了番茄第二号染色体。术分离了番茄第二号染色体。
