1、北京城区不同水域水体沉积物浸出液北京城区不同水域水体沉积物浸出液对蟾蜍蝌蚪影响的研究对蟾蜍蝌蚪影响的研究马 越 高家思指导教师：北京师范大学指导教师：北京师范大学 刘新会 教授 彭安 高级实验师北京师范大学第二附属中学北京师范大学第二附属中学 张慧 该项目获得该项目获得 2010 年年第 30 届北京青少年科技创新大赛一等奖摘要为探究北京地区不同水域水体沉积物浸出液对中华大蟾蜍及非洲爪蟾蝌蚪的影响，分别取颐和园昆明湖、积水潭太平湖和什刹海前海三个水域共 9 个采样点的沉积物和表层水，制 备相应采样点的沉积物浸出液，并以曝气 3 天后的自来水为对照组，培养中华大蟾蜍和非洲爪蟾的受精卵。记录蟾蜍蝌
2、蚪 72h 出膜率和不同培养时间的成活率，并 测定不同时期蝌蚪的超氧化物歧化酶（SOD）的活性；同时测定沉积物浸出液中的 Pb（铅）、 Cu（铜）等重金属元素的含量。结果分析表明：蝌蚪成活率随着生长在浸出液里的时间的增加而减少；在北京城区，越靠近城中交通繁忙地带，蟾蜍蝌蚪的 SOD 活性越低；蟾蜍蝌蚪的出膜率、在某些培养时期的成活率与沉积物浸出液中重金属含量呈线性关系。关键词沉积物浸出液；中华大蟾蜍；非洲爪蟾；蝌蚪；出膜率；成活率；SOD 活性1课题介绍1.1 选题的产生选题的产生环境污染就是指人类直接或间接地向环境排放超过其自净能力的物质或能量，从而使环境的质量大幅降低的现象，它对人类的生存
3、与发展和生态系统的和谐造成一定的负面影响。随着经济的快速增长以及城市化进程的不断扩大，环境污染日趋严重。由于我国污水处理能力不足，大量的工业废水、生活污水等排入自然水体。随着时间延长，污染物在沉积物中逐渐积累，威胁着水生生物的健康。同时，当环境受到扰动时，污染物容易沉积物中释放出来，从而形成“二次”污染。因此，沉积物 -水环境构成的环境体系因其复杂、动态污染的特点成为研究热点 1。生态环境是一个极其复杂的体系，它是生物与环境相互作用的统一整体，环境中的各种理、化条件的改变直接影响到生活在该环境中的生物，从而影响到生物体的内部功能和种间关系，以至影响生态系统的稳定性；同时，生物不断地影响、改变着
4、环境，二者相互依存、协同进化。环境污染的危害最终表现为对生物的影响。因此，本课题选取了胚胎发育和胚后发育在水中完成的两栖类中华大蟾蜍和非洲爪蟾为实验动物，记录两种蟾蜍的蝌蚪在北京城区不同水域的沉积物浸出液中的 72h 出膜率和不同培养时间的成活率，并测定不同时期蝌蚪的超氧化物歧化酶（SOD）的活性，分析沉积物浸出液对实验动物的影响，从而探究北京城区不同区域水质与人类活动的关系及不同区域水质对实验动物生物的影响。1.2 研究设想和拟解决的问题在实验中，拟观测蟾蜍蝌蚪的出膜率和成活率，检测不同发育阶段蟾蜍蝌蚪的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD)活性。其中，超氧化物
5、歧化酶对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基（O 2-）从而保护细胞免受损伤，当机体受到重金属等污染时，会导致生物体体内的 SOD 活性一般会发生显著变化，据此通过与正常生物体的比较就可以得知污染对生物体影响的程度 2。将实验结果与研究区域沉积物浸出液理化检测结果进行相关性分析，据此了解北京城区水环境现状，从而更加关注和爱护水资源。2 研究研究 思路与过程思路与过程本课题主要通过实地考察采样地点，取沉积物及对应的表层水体制备沉积物浸出液。以沉积物浸出液为水环境进行生物实验，分析结果、得出结论，实验流程如图 1。查阅相关资料并实地考察，确定采样地点查阅相关资料并实
6、地考察，确定采样地点实验前准备实验前准备 制备北京城区不同水域沉积物浸出液；制备北京城区不同水域沉积物浸出液； 促性成熟蟾蜍排卵促性成熟蟾蜍排卵设计实验步骤设计实验步骤实验二：实验二： 测定蟾蜍蝌蚪测定蟾蜍蝌蚪不同发育时期超氧化物不同发育时期超氧化物歧化酶（歧化酶（ SOD）活力值）活力值目的：检测不同水质对目的：检测不同水质对蟾蜍蝌蚪的生理机能的蟾蜍蝌蚪的生理机能的影响影响通过分析，得出北京城区不同水域水体沉积物浸出液对蟾蜍蝌蚪的影响通过分析，得出北京城区不同水域水体沉积物浸出液对蟾蜍蝌蚪的影响与导师进行沟通，确定课题研究方向与导师进行沟通，确定课题研究方向实验一：实验一： 观测蟾蜍蝌蚪观测
7、蟾蜍蝌蚪72 小时出膜率及不同小时出膜率及不同发育阶段的成活率发育阶段的成活率目的：观察蟾蜍蝌蚪在目的：观察蟾蜍蝌蚪在不同水环境下的生长情不同水环境下的生长情况况图 1 技术路线流程图主要操作步骤如下：确定采样地点：经过文献及实地考察，根据方位、交通繁忙程度等采样原则，粗略的确定北京城区主要自然及人工水体作为研究区域。然后，进行实地环境考察，根据研究区域的周围环境进行可行性分析，最终确定下来不同水域的沉积物及对应的表层水的采样地点。实验三：实验三：检测沉积物浸出液中的检测沉积物浸出液中的重金属元素含量重金属元素含量目的：分析蟾蜍蝌蚪出目的：分析蟾蜍蝌蚪出膜率、成活率、膜率、成活率、 SOD活活
8、性变化与重金属元素含性变化与重金属元素含量的关系量的关系分析北京城区不同水域水体沉积物浸出液对蟾蜍蝌蚪的影响：通过对不同水域中重金属含量数值与蟾蜍蝌蚪 72 小时出膜率、不同发育阶段成活率和SOD 活性的对照分析，探究不同水质对实验动物的影响。两种环境检测结果的相关性分析：分别对环境样品进行选定污染物重金属含量的理化检测与生物检测，对照两种检测方法的结果，将理化检测和生物检测相结合揭示环境状况，以弥补单一检测的缺点与不足。3 材料与方法材料与方法3.1 实验动物实验动物采用性成熟的中华大蟾蜍（4 对）及非洲爪蟾（2 对）作为实验动物，相关信息见表 1。表 1 实验动物来源及状态表平均体重（g）
9、数量（只） 性别 动物来源中华大蟾蜍 126.37 4 河北地区中华大蟾蜍 220.76 4 河北地区非洲爪蟾 89.68 2 中国科学院遗传与 发育研究所非洲爪蟾 127.51 2 中国科学院遗传与 发育研究所3.2 实验仪器、试剂实验仪器、试剂仪器：多功能酶标仪、恒温水浴锅、冷冻离心机、电感耦合等离子光谱仪、旋涡混匀器、电子天平、微量式移液器、抓斗取泥器、2000ml 取水器等。试剂：注射用人绒毛膜促性腺激素（hCG,丽珠医药） 、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物科技有限公司） 、超氧化物岐化酶测试盒（南京建成生物科技有限公司） 、冰醋酸、生理盐水等。3.3 沉积物与水样的采集和制备
10、沉积物与水样的采集和制备经过文献及地理资料查阅结合实地环境考察，以方位上由北向南，空间上由外到内的顺序依次选取什刹海前海（地点 1） 、积水潭太平湖（地点 2） 、颐和园昆明湖（地点 3）作为研究区域，见图 2；并分别在这三个区域内各以交通较繁忙，远离人类活动区域的地方为标准选取三个不同的地点作为采样点 3，见图 3。321图 2 所研究的不同水域在北京城区的分布图注：1 积水潭太平湖 2 什刹海前海 3 颐和园苏州街图 3 3 个研究水域的 9 个采样点具体示意图注：1-1 积水潭桥西 500m1-2 积水潭桥西 100m1-3 积水潭桥东 100m2-1 前海“严禁过桥”处2-2 前海金锭
11、桥2-3 前海中央3-1 颐和园苏州街3-2 颐和园十七孔3-3 颐和园昆明湖中央采用取水器和抓斗式采泥器，分别采集表层水样及沉积物样品。称取沉积物 200g 于塑料桶内，加入 2000ml 对应地点的水样，用玻璃棒将沉积物充分搅拌至悬浮状态，静置 12h，得到沉积物浸出液 4。3.4 实验操作实验操作 .3.4.1 性成熟蟾蜍的实验室促排卵过程性成熟蟾蜍的实验室促排卵过程将性成熟的中华大蟾蜍（4 对）和非洲爪蟾（2 对）分别饲养在半透明的大水族箱中，养殖用水为曝气 3 天后的自来水，并用碎石子在水中堆起成岛屿，为蟾蜍提供水、陆两种生活环境。一周后，对雌雄蟾蜍分别腹腔注射 700IU 和 80
12、0IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG ） 。24h48h 后，雌蟾蜍排卵，记录排卵时间，观察其在水中出膜情况情况。3.4.2 蟾蜍蝌蚪 72h 出膜率、不同培养时间成活率的测定收集受精卵卵带，将其依次剪开为每 30 个卵一段，分别置于盛有沉积物浸出液的孔板中，每天换水一次，不予以投食，72h 后进行蟾蜍蝌蚪出膜率统计。然后将蝌蚪转移到盛有 500ml 沉积物浸出液的烧杯中继续实验。每天换水一次，用新制的熟鸡蛋黄悬浊液每天进行投食 5，随蝌蚪生长，每个烧杯中的投食量递增，量以 30min 内吃完为宜。对于中华大蟾蜍，分别于培养 114h 和 274h 后进行成活率的统计。对于非洲爪蟾，由于其发育过
13、程较为缓慢，分别于培养 127h 和 448h 后进行成活率的统计。3.4.3 蟾蜍蝌蚪的蟾蜍蝌蚪的 SOD 活性值的测定活性值的测定组织匀浆中总 SOD 活力（U）计量单位：每毫克组织蛋白在 1ml 反应液中SOD 抑制率达 50%时所对应的 SOD 量为一个 SOD 活力单位（U） 。为检测蝌蚪体内 SOD 活力值，分别在中华大蟾蜍受精卵培养 10 天、20 天、30 天、40 天后进行测定。而对非洲爪蟾，则在其受精卵培养 20 天和 60 天时分别进行 SOD 活力值的测定。组织匀浆介质的制备：将 Tris 1.21g EDTA2Na 37.23mg 加蒸馏水 500ml，再用 200m
14、mol/L HCl 进行滴定至 pH7.4，然后加入蔗糖 3.42g、氯化钠 8g，再用蒸馏水定容至 1000ml，以 121,30min 进行消毒后冷却至室温置于 4冰箱中备用。SOD 酶液的制备：将在沉积物浸出液中培养不同时间的蝌蚪置于匀浆介质中，用超声破碎仪进行细胞破碎，在 4条件下采用冷冻离心机进行离心，取其上清液，得到 SOD 酶液。SOD 酶检测液的配制及组织匀浆样品检测：严格依照 SOD 试剂盒说明书（见表 2）进行检测液的配制和 SOD 酶活性的测定。表 2 总超氧化物歧化酶（ T-SOD）活力的测定试剂 测定管 对照管试剂一（ml） 1.0 1.0样品（ml） 200ul蒸馏
15、水（ml） 200ul试剂二（ml） 0.1 0.1试剂三（ml） 0.1 0.1试剂四（ml） 0.1 0.1用旋涡混匀器以 35004000rpm 的速度充分混匀，置 37恒温水浴 40min。显色剂（ml） 2混匀，室温放置 10 分钟，与长波 550nm 处，1cm 光径色比环，蒸馏水调零，比色。SOD 活性的计算： )/()/( )(50%-SOD mlgprotmgprotU ml组 织 中 蛋 白 含 量取 样 量反 应 液 总 体 积对 照 管 吸 光 度测 定 管 吸 光 度对 照 管 吸 光 度活 力 3.4.4 沉积物浸出液中重金属含量的测定沉积物浸出液中重金属含量的测定
16、用电感耦合等离子光谱仪测定得到重金属元素含量 6。4 结果 与讨论4.1 实验动物出膜率和成活率的测定结果实验动物出膜率和成活率的测定结果将中华大蟾蜍、非洲爪蟾的受精卵在沉积物浸出液中培养 72h 后，进行出膜率统计，结果见图 4、图 5。67% 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水潭 桥西 500m积 水潭 桥西 100m积 水潭 桥东 100m前 海严 禁过 桥处前 海金 锭桥前 海中 央颐 和园 苏州 街颐 和园 十七 孔桥颐 和园 昆明 湖中 央空 白对 照组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%33%0%
17、100%67%33%100%36%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水 潭桥 西 50m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和
18、园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20%40%6080%100%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%3%0%10%67%3%10%36%52%0%20%40%60%80%10%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 100m积
19、水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%）积 水 潭桥 西积 水 潭桥 西积 水 潭桥 东前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点出膜率（）积 水 潭桥 西积 水 潭桥 西积 水 潭桥 东前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地
20、点出膜率（）图 4 中华大蟾蜍培养 72h 的出膜率95%61%86% 91%61%80%45%65% 56% 75%0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%积 水潭 桥西 500m积 水潭 桥西 100m积 水潭 桥东 100m前 海严 禁过 桥处前 海金 锭桥前 海中 央颐 和园 苏州 街颐 和园 十七 孔桥颐 和园 昆明 湖中 央空 白对 照组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前
21、 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20
22、%40%60%80%100%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%3%0%10%67%3%10%36%52%0%20%40%60%80%10%120%积 水 潭桥 西 50m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采
23、 样 地 点72h出膜率（%）积 水 潭桥 西积 水 潭桥 西积 水 潭桥 东前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点出膜率（） 67% 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20%40%60%80%10%120%积 水 潭桥 西 50m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%）图 5
24、 非洲爪蟾培养 72h 的出膜率对比两种蟾蜍的受精卵培养 72h 的出膜率可以看出，除前海金锭桥和颐和园十七孔桥两个地点外，其余地点的沉积物浸出液组中华大蟾蜍的蝌蚪出膜率低于非洲爪蟾的出膜率。将中华大蟾蜍受精卵在沉积物浸出液中培养 114h 和 274h 后，进行蝌蚪成活率统计，结果见图 6。65%100% 100%0%99% 100%17%46%81%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水潭 桥西 500m积 水潭 桥西 100m积 水潭 桥东 100m前 海严 禁过 桥处前 海金 锭桥前 海中 央颐 和园 苏州 街颐 和园 十七 孔桥颐 和园 昆明 湖中 央空 白对 照组
25、采 样 地 点成活率（%）培 养 114h的 成 活 率 培 养 274h的 成 活 率67 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 10
26、0m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%）67% 67%33%0%100%67%33
27、%100%36%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%3%0%10%67%3%10%36%52%0%20%40%60%80%10%120%积 水 潭桥 西 500m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆
28、 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%） 67% 67%33%0%100%67%33%100%36%52%0%20%40%60%80%100%120%积 水 潭桥 西 50m积 水 潭桥 西 100m积 水 潭桥 东 100m前 海 严禁 过 桥处前 海 金锭 桥 前 海 中 央颐 和 园苏 州 街颐 和 园十 七 孔桥颐 和 园昆 明 湖中 央空 白 对照 组采 样 地 点72h出膜率（%）图 6 中华大蟾蜍受精卵培养 114h、274h 后的成活率结果：中华大蟾蜍受精卵培养 114h 成活率范围为 46%100%。其中，积水潭和前海的沉积物浸出液组中华大蟾蜍蝌蚪成活率较高，除积水潭桥西 500m对应的成活率较低（65%）外，其余均处于 85%以上。而颐和园沉积物浸出液组中华大蟾蜍成活率均低于 85%，相对较低。随着培养时间的延长，中华大蟾蜍蝌蚪的成活率降低，培养 274h 的成活率大部分处于 55%以下。将非洲爪蟾受精卵在沉积物浸出液中培养 127h 和 448h 后，进行成活率统计，结果见图 7。
