1、靶向Del-1蛋白的肿瘤血管阻断剂与新生血管抑制剂双效抗体药物的制备,龙益如,王慧,指导老师,答辩人,编辑标题,团队成员,Part 1,Part 2,Part 3,研究思路与方法,绪 论,应用前景,目录,Contents,绪 论,Part 1,选题背景,相关研究状况,研究意义,1.1 选题背景,Del-1（developmentalendothelial locus-1）最早被发现是一种在胚胎血管生成过程中由内皮细胞分泌的ECM蛋白，具有促进血管形成的作用，是一种重要的血管再生因子和免疫调节因子。,1.1 选题背景,Del-1蛋白含有三个重复表皮生长因子EGF样结构域和两个盘状结构样结构域。其
2、第二个EGF结构域（EGF2）包含一个可结合整合素的重要模体，RGD模体（Arg-Gly-Asp），两个盘状结构域则可结合磷脂酰丝氨酸，特殊的结构决定了Del-1在细胞微环境中发挥的功能。,1.Del-1促肿瘤血管生成作用,结合v3,2.Del-1促进肿瘤生长及转移,1.3 研究意义,学术研究意义,社会效益,可用于治疗肝癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌等癌症肿瘤，为恶性肿瘤治疗提供新的选择，帮助病人减轻病痛，提高其生活质量。,经济效益,制成制备相应抗体药物可用于肿瘤检测和治疗，将会有很大经济效益。,01,02,03,研究思路与方法,Part 2,理论依据,研究思路,可行性说明,2.1 理论依据,3,个
3、依据,研究的三个理论依据,理论依据一,理论依据二,理论依据三,Del-1蛋白在肿瘤微环境中高表达，在正常人组织器官中仅部分部位表达如眼等。Del-1蛋白在肿瘤新生血管生成、抗肿瘤血管内皮细胞凋亡以及肿瘤转移和复发等多信号通路中发挥重要作用。,凝血酶原在凝血机制中起到中心作用，且其转化为凝血酶之后才具有相应活性，而凝血酶原和Del-1蛋白在与整合素结合均依赖RGD模体，可能存在共同抗原。,单克隆抗体的制备技术和小分子抗体制备方法为我们提供了技术手段。,思路,A,B,C,D,E,兵马未动粮草先行,切断运粮通道,Del-1蛋白靶点,抗体导弹,亲和力、凝血酶原,2.2 研究思路,DEL-1蛋白的3D构
4、型,2.2.1 Del-1相关情况,2.2.1 Del-1相关情况,分子量及其特征,Del-1蛋白的序列展示,2.2.1 Del-1相关情况,Del-1蛋白中EGF-2的结构域放大,2.2.1 Del-1相关情况,实验所用具体材料,2.2.1 Del-1相关情况,材料,动物免疫,饲养细胞的制备,瘤细胞SP2/0的制备,免疫脾细胞的制备,细胞融合,阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆,细胞冻存与复苏,单抗腹水的制备及效价的测定,1,2,3,4,5,6,7,9,8,2.2.2 抗Del-1蛋白的单克隆抗体的制备,培养基及血清：胎牛血清、RPMI 1640培养基；试剂：HT、HAT、PEG3500、CFA、I
5、FA、DMSO；细胞系：骨髓瘤细胞系 SP2/0 本校实验室保存；Balb/ C 小鼠若干；,2.2.2 抗Del-1蛋白的单克隆抗体的制备,一、假设小分子抗体与凝血酶原能够结合,肿瘤细胞,Del-1,血管,Del-1抗体,凝血酶原,2.2.3 筛选满足亲和力条件的抗体,酶免疫技术法（ELISA）：（1）将单位量Del-1蛋白吸附于固相载体上，洗涤，封阻。（2）用辣根过氧化物酶（HRP）根据过碘酸盐氧化交联法进行抗体标记,将酶标抗体加入孔内。（3）洗涤未反应物。（4）加入底物（TMB）。（5）加入浓硫酸终止反应，测OD值，检测显色反应的程度，记录。（6）加入第二种抗体（单位量），重复前面步骤，
6、直至全部检测完。（7）根据显色程度大小，将抗体按与Del-1亲和力的大小进行排序。,2.2.3 筛选满足亲和力条件的抗体,酶免疫技术法（ELISA）:排序后，按亲和力从大到小的顺序，同理用ELISA将抗体与凝血酶原反应，检测反应亲和力，并与上面步骤进行比较，直至筛选出满足“抗体Del-1亲和力大于抗体凝血酶原亲和力”的抗体。,筛选满足亲和力条件的抗体,2.2.3 筛选满足亲和力条件的抗体,2.2.4 凝血酶原修饰连接,采用流式细胞仪确定抗原抗体结合表位。然后利用基因拼接技术（基因工程），在融合蛋白作用下，将表位与酶原连接，这样就可保证抗体与酶原结合。,基因工程,凝血酶原可视为载体，筛选得到的抗
7、原表位视为半抗原，用碳化二亚胺法将两者连接，测偶联比。最后用ELISA找到想要的偶联物。,蛋白质工程,当抗体不满足亲和力条件时,采用脂质体包埋法，将脂质体包埋在酶原上，制成多囊颗粒。增加酶原稳定性。,酶固定化法,根据肿瘤细胞特有的Warburg反应，可将PKM2结合蛋白结合在酶原上，待其进入肿瘤微环境后可被特异性结合、酶解，而不破坏酶原。,能量底物法,对于酶原在机体的保护,2.2.5 测小分子抗体的效价、亲和力、特异性,3,-70保存,将交联剂PMPI粉末溶于DMSO，CA4P，再加入PBS缓冲液，按一定物料比，分批加入，轻轻搅拌，反应数小时,将还原性抗体与PMPI-CA4P按一定比例偶联琼葡
8、糖凝胶脱盐,将抗体与还原剂TCEP以一定比例混合搅匀，反应1h后，超滤除盐,2.2.5 偶联物纯化，偶联比检测方法,一、偶联步骤,SDS-PAGE非还原性电泳,紫外分光光度法粗测偶联比,液质联用测量药物抗体偶联比例,二、偶联比的测定,三、其他血管阻断药物偶联备选ENMD-1198反式-3，5，4-三甲氧基白藜芦醇血栓素蛇毒蛋白(SVTLE),2.2.5 偶联物纯化，偶联比检测方法,对比试验同类筛选,2.2.7 临床前研究,实验试剂：人胰腺癌细胞细胞株，SPF级BALB/C小鼠人源细胞荷瘤裸鼠模型的建立：取对数生长期的胰腺癌细胞，用无血清培养基重悬至浓度为2*107个。选取体重20g左右，68周
9、龄的雌性小鼠，腹腔注射麻醉剂，待麻醉后，于右侧背部皮下注射细胞悬液进行接种。肿瘤生长至200mm3时，进行后续试验。,2.2.7 临床前研究,1.检查药物的靶向性：用荧光标记的抗DEL-1单抗-凝血酶药物经尾静脉注射入小鼠体内，分别在给药4,12,24,48h后，对老鼠进行活体荧光检测。24h后处死小鼠，收集心、肝、脾、肾、肺、肿瘤等组织检测荧光强度。,2.2.7 临床前研究,2.3 可行性说明,可行性分析,二、小分子抗体制备,小分子抗体分子量小，方便携带凝血酶原并通过血液循环运输到靶点。保留抗原识别功能，摒弃了Fc段无关作用。,四、偶联物纯化，偶联比检测,交联剂选择分子量较小的，在体内稳定性
10、较好偶联物和小分子药物结合时，结合基团的选择原则是尽量降低其异物性小分子药物达到靶点可能无法解离，无法发挥药效,三、凝血酶原修饰,如果凝血酶原在运输途中掉落，可对其进行固定化如果凝血酶原太大可对其进行修饰，不过可能改变其亲和力。如果凝血酶原的亲和力无法达到要求，则对其进行基因工程改造，添加新的抗原表位若凝血酶原上无法构建出适合的抗原表位，则选用凝血系统中的其他凝血因子，重复以上实验,一、del-1的获取,所需骨髓瘤细胞和小鼠皆可购买，构建方法简单已知凝血酶原与del1存在交叉抗原RGD，很可能是我们需要的抗原表位,2.3 可行性说明,应用前景,Part 3,应用前景,应用前景一,应用前景二,应用前景三,为肿瘤血管阻断剂及新生血管抑制剂，双效药物的制备提供研究基础,用于胰腺癌、肝癌、肺癌、大肠癌的辅助治疗,Del-1抗体还可以与其他抗肿瘤药物偶联制成新的抗癌药物。,感谢您的批评指正,
