1、题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一病理科30生效日期：2012 年 1 月 1 日 版本号 1.0修改日期： 页码 1/13病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范一、病理科免疫组织化学技术员培训规范：凡新入我科的病理技术员均需进行免疫组化理论知识的学习、培训，经考核合格、具备病理技术员技士资质后方能从事免疫组织化学染色。二、病理科免疫组织化学染色操作规范1.免疫组织化学染色前的准备事项(一)组织切片的制备常规切片脱蜡至水（组织固定需用 10%中性甲醛） (二)抗体的选择、稀释和保存（1）选择抗体应先了解其反应谱和适用条件包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、稀释度和温育
2、时间等。（2）对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验;根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度（3）抗体的原液应于分装后置于一 20冷室中保存，切勿反复冻存(以免效价 降低)。（4）抗体的工作液可置于 4冰箱中保存。（5）抗体的稀释。(1)一般用 0.01M PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，pH 值 7.2。(2)或用 0.05M TBS(生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液)，pH 值 7.6。(3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。(三)被检测组织内抗原的修复（1）经 4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定
3、的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前，对于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。（2）抗原修复缓冲液。(l)一般为 0.01M 柠檬酸缓冲液(2.1g 柠檬酸溶于 100ml 蒸馏水中，用 2M NaOH 调节 pH 值至 6.0)。(2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高 PH 值的 EDTA(50mM Tris.，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该题目：病理科免疫组织
4、化学技术员培训及技术操作规范 市一病理科30生效日期：2012 年 1 月 1 日 版本号 1.0修改日期： 页码 2/13高 pH 修复液等。（3）抗原修复的常用方法。(l)胰蛋白酶消化法: 组织切片脱蜡、水化。滴加一滴 0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。37下温育 20-40min(温育时间取决于组织经 4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。蒸馏水冲洗，终止反应。阻断内源性过氧化物酶。进行免疫组织化学染色。（配制 0.1%胰蛋白酶液时，应将 0.1g 胰蛋白酶溶于 0.1%无水氯化钙水溶液(pH 值 7.8)中。）（2)胃蛋白酶消化法:组织切片脱蜡、水化.滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。
5、37下温育 10-30min(一般为 10min，可延至 30min，取决于组织经 4%中性甲醛固定时间的长短).浸人蒸馏水，终止反应。进行免疫组织化学染色。用 1%胰蛋白酶液 37下处理 20min。(应以 0.1M HCI 配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片 脱落。)（3)微波修复抗原法:组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修复液 200ml，盖上具有小孔的盖子。将该容器置于微波炉(705-800W)中央加热(95)5min，2 次(于两次之间，应向容器中添加蒸馏水50ml，严防组织切片干燥
6、)。将该容器移出微波炉，置于室温下冷却 15-20min。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。用 TBS 或 PBS 液冲洗。进行免疫组织化学染色。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一病理科30生效日期：2012 年 1 月 1 日 版本号 1.0修改日期： 页码 3/13(4)热水浴法:组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。向装组织切片的容器加人足量(例如 200ml)抗原缓冲液，置于水浴锅中，加热至 95 -99(不沸腾)预热。将组织切片插人已预热的容器内，温育 20-40min。将该容器由微波炉移出，置于室温下冷却 20min。 室
7、温下，用 TBS、PBS 或水洗。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。用 TBS 或 PBS 液冲洗。进行免疫组织化学染色。（5)压力锅法:组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。向 4-5.5L 的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液(约为锅容积的 2/3)， 不加阀情况 下加热至沸腾。将组织切片插放于金属切片架上，并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。加阀情况下，将组织切片加压 2min。压力锅自行冷却或以流水冷却减压后，持续 20min。将冷却后的切片取出，蒸馏水冲洗后，置于 TBS 或 PBS 液中(以免组织切片干燥)。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶，而后将切
8、片置于蒸馏水中。用 TBS 或 PBS 液冲洗。进行免疫组织化学染色。（四）组织切片中内源性酶的阻断1.内源性过氧化物酶 主要存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞了嗜酸性粒细胞和组织内。阻断方法:最常用 0.3%-0.5%H2O2-甲醇液，作用 15-30min， 阻断液必须使用时新鲜配制。由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性(使特异性着色减弱)，而大部分组织不含有内源性过氧化物酶，所以阻断内源性过氧化物酶一般不必作为常规步骤。必须阻断内源性过氧化物酶时，可安排在第一抗体反题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一病理科30生效日期：2012 年 1 月 1 日 版本号
9、1.0修改日期： 页码 4/13应后进行，以减少抗原的破坏。2.内源性碱性磷酸酶 主要存在于嗜中性粒细胞和内皮细胞。阻断方法:应用 1M 左旋咪唑，作用 15-30min。3.内源性生物素 肝、胰、肾等的细胞内含有多量生物素或类生物素物质。 阻断方法:先将切片浸于卵白素(0.5g/ml)中 15min，以缓冲液洗净后，移浸于生物素饱和溶液中 15min，再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液;也可应用商供的阻断试剂盒(按说明书操作)。(五)正常血清保护作为检测试剂的抗体蛋白带有一定的负电荷，免疫组织化学染色时，易与带有正电荷的组织特别是纤维组织、变性和(或)坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等发生静电吸引而导
10、致非特异性染色。去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加第一抗体前，先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或是滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为 1：5-1：20;必要时可滴加 2%-5%牛 血清清蛋白。正常血清保护作用时间 10-20min。用于阻断非特异性结合的血清不能有明显的溶血。(六)缓冲液用于稀释抗体，洗涤切片的缓冲液主要有两种。1.TBS(0.05M，pH7.6)，Tris 一 HCl 缓冲液(0 .SM，pH 7.6) 100ml8 .5%NaCl 100ml蒸馏水加至 1000mlTris 一 HCI 缓冲液(0 .5M，pH7.6)三经甲基氨基甲烷(Tr
11、is) 61gHCl 37ml蒸馏水加至 1000ml2PBS(0 .IM，pH 7.6) Na2 HPO4 12H2O2 29gNaH2PO4 2H2O 3gNaCl 85g蒸馏水加至 1000ml使用时用蒸馏水稀释 10 倍即成 0.0lM。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一病理科30生效日期：2012 年 1 月 1 日 版本号 1.0修改日期： 页码 5/13二、免疫组织化学染色常用方法(一)直接法1.脱蜡和水化。2.3%过氧化氢或 0.5%过氧化氢甲醇液，5min。 3.TBS 或 PBS 缓冲液洗涤。4.抗原修复。5.无关动物正常血清(适当稀释)20-30min
12、。6.甩去正常动物血清，滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体，或增强的酶标多聚物一步法(Enhanced Polymer One-step Staining，EPOS)抗体于切片上， 20-60min。7.TBS 或 PBS 缓冲液洗涤。8.0.04%-0.05%DAB(二氨基联苯胺四盐酸)H2O2 液显色 5-10min，镜下观察控制显色时间。底物配法:DAB 40-50mg；0.05M TBS(pH 7.6) l00ml；3% H2O2 100-200ml。9.缓冲液洗，流水洗涤。10.苏木精淡染细胞核。11.脱水，透明，封片。(二)间接法l-5 步同“直接法”。6.滴加第一抗体于切片上，
13、湿盒内温育 30-60min。7.TBS 或 PBS 缓冲液洗涤。8.HRP 标记抗体或用增强的酶标记多聚物(Enhanced Labeled 一 Polymer Sys- tem，ELPS)抗体滴加切片上，湿盒内温育 30min。9-14 步同“直接法”的 7-11 步。(三)过氧化物酶一抗过氧化物酶(PAP)法1-5 步同直接法。6.适当稀释的第一抗体，湿盒内温育 30-60min。7.缓冲液洗涤。8.第二抗体，湿盒内温育 30min。9.缓冲液洗涤。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一病理科30生效日期：2012 年 1 月 1 日 版本号 1.0修改日期： 页码 6/
14、1310.滴加 PAP，湿盒内温育 30min。11-15 步同“直接法”的 7-11 步。双 PAP 法:上述操作进行到第 10 步后，再重复 7-10 步 1 次，然后继续 11-15 步。(四)葡萄球菌 A 蛋白(SPA)免疫酶法1-5 步同“直接法”。6.第一抗体，湿盒温育 30-60min。7.缓冲液洗涤。8.酶联 SPA，湿盒温育 30min。9.缓冲液洗涤。10-13 步同“直接法”的 8-11 步。(五)ABC 法和 SABC 法ABC 法是卵白素-生物素-酶复合物(Avidin-Biotin-Peroxidase Complex)法的简称。SABC 法是链霉卵白素-生物素-酶
15、复合物(Streptavidin 一 Biotin 一 peroxidase Complex)法的简称。l-5 步同“直接法”。6.第一抗体，湿盒温育 30-60min. 7.缓冲液洗涤。8.生物素化的第二抗体，30min。9.缓冲液洗涤。10.ABC 复合物或 SABC 复合物(皆于使用前新鲜配制)，30-60min。11-15 步同“直接法”7-11 步。(六)LSAB(SP)法LSAB(SP)法，是标记的链酶卵白素-生物素(Labeled Streptavidin-Biotin)法的简称，操作步骤同“ABC 法”，只是以 LSAB 复合物替代 ABC 复合物。(七)CSA 法CSA 法是
16、催化信号放大(Catalyzed Signal Amplifieation)法的简称。1-5 步同“直接法”。6.第一抗体，15-30min。7.缓冲液洗涤。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一病理科30生效日期：2012 年 1 月 1 日 版本号 1.0修改日期： 页码 7/138.生物素标记的第二抗体，15-30min。9.缓冲液洗涤。10.链霉卵白素-生物素-HRP 复合物(用前新鲜配制)，15min。11.缓冲液洗涤。12.放大液，15min。13.缓冲液洗涤。14.HRP-StrePtavidin， 15min。15-19 步同“直接法”的 7-11 步。(八)二
17、步法 Envision SystemEnvision 是通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体。1-5 步同“直接法”。6.第一抗体，30-60min。7.缓冲液洗涤。8 .Envision TM，10-30min。9-13 步同“直接法”的 7-11 步。(九)双重免疫组织化学法1 .Sequential (1)鼠或兔抗体 1，30-60min。(2)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/HRP，30 min。(3)DAB(棕色)，2-10 min。(4)鼠或兔抗体 2，30-60 min。 (5)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/AP，30 min。(6)AP(红色)。2 .Sim
18、nl 一 Aaneous(1)混合鼠抗体 1 和兔抗体 2，4，过夜或 60 min。(2)Envision TM 羊抗鼠/HRP 和羊抗兔/AP。(3)AP 染色。(4)HRP 染色。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一病理科30生效日期：2012 年 1 月 1 日 版本号 1.0修改日期： 页码 8/13上述方法除注明温度者外，均可在室温(20-25)环境中进行;第一抗体温育后，如有必要可置于 4下过夜。三、免疫组织化学染色的常用抗体标记物(一)上皮源性标记物1.一般性标记物（1）CK(角蛋白)CK 亚型:CK5/6;CK7;CK8;CK10/13;CK18;CK19;
19、CK20。(2)EMA(上皮细胞膜抗原)。2.特异性和(或)相对特异性上皮标记物（1）CEA(癌胚抗原，标记胃癌、大肠癌).（2）CA242(肿瘤相关粘液抗原，标记胰腺癌、大肠癌)。（3）TG(甲状腺球蛋白，标记甲状腺癌).（4）PSA(前列腺特异性抗原，标记前列腺癌)。（5）PSAP(前列腺特异性酸性磷酸酶，标记前列腺癌).（6）34E12(标记前列腺底细胞).（7）AFP(甲胎蛋白，标记肝癌、内胚窦癌).（8）Hepatoeyte(标记肝细胞癌)。(9)-HCG(-绒毛膜促性腺激素，标记胎盘滋养层细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤).（10）CA125(卵巢癌).（二)间叶源性标记物主要是 Vimen
20、tin(vim，波形蛋白)等.（三）肌源性标记物1.Desmin(Des，结蛋白)2.Actin(肌动蛋白）.3.SMA(平滑肌肌动蛋白).4.MSA(肌特异性肌动蛋白). 5.Myosin(肌球蛋白).6.Myoglobin(MG，肌红蛋白)题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一病理科30生效日期：2012 年 1 月 1 日 版本号 1.0修改日期： 页码 9/137.Myogen(肌浆蛋白).8.MyoDI(肌调节蛋白).(四)血管源性标记物 FRAg(第 8 因子相关抗原).CD31CD34UEA-lBNH9.(五)组织细胞源性标记物 1 .CD68/KP-l.2.Ly
21、sozyme(溶菌酶)。3.a1-AT(a1-抗胰蛋白酶).4.a1-ACT(al-抗胰糜蛋白酶) 5.Mac387. 淋巴造血组织源性标记物1.全淋巴细胞(1)CD45/LCA(白细胞共同抗原）。(2)TdT(末端脱氧核昔酸转移酶)。(3)CD30/Ki-1。2.全 B 细胞 (1)Ig。(2)Ig。(3)CD20/L26。(4)CD79a。(5)BLA36(B 淋巴细胞抗原)。 3.B 细胞亚型(1)CDl0。(2)CD21(标记滤泡性树突状细胞)。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一病理科30生效日期：2012 年 1 月 1 日 版本号 1.0修改日期： 页码 10/
22、13(3)CD23。 (4)CD35(标记滤泡性树突状细胞)。(5)CD38.4.全 T 细胞 (1)CD3。(2)CD5。 (3)CD43。(4)CD45RO/UCHL-1.5.T 细胞亚型 (1)CDla。(2)CD4。 (3)CD8。 6.NK 细胞 (1)CD56。(2)CD57/Leu-7。(3)CD16/Leu-11。7.粒细胞和单核巨噬细胞 (1)CD11c/LeuM5。 (2)CD15/LeuM5。(3)Lysozyme(溶菌酶)。 (4)al-AT(al-抗胰蛋白酶)。 (5)al-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)。(6)CD68.(7)S-100 蛋白.(8)Mac387。 8.其他 (1)EMA(上皮细胞膜抗原).(2)CD99(尤因肉瘤标记物).
