1、本科毕业论文（20 届）利用靶向中枢神经系统的外泌囊泡戒除阿片类精神依赖性药物的研究所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 2 -本科生毕业论文（设计、作品）中文摘要利用靶向中枢神经系统的外泌囊泡戒除阿片类精神依赖性药物的研究摘要：细胞分泌的为囊泡已经被证明是一种是细胞之间传递小 RNA 的有效载体，也是一种被广泛认可的用于基因治疗的传输工具。在此次研究中，我们使用改造过的在膜表面表达了狂犬病毒糖蛋肽（RVG）短肽的外泌小体向中枢神经系统中输送阿片类受体 （MOR）的 siRNA，用以治疗阿片类精神性药物的上瘾。我们发现 受体的 siRNA 可以成功
2、的包裹进外泌小体中。这些外泌小体也能够成功地将 受体的 siRNA 输送到神经元细胞 Neuro2A 和小鼠的脑组织中。从功能上看，装载了 siRNA 的 RVG 外泌小体可以特异性地下调 受体的 mRNA 和蛋白表达水平。令人惊讶的是，传送进中枢神经系统的 受体的 siRNA 通过下调 受体的蛋白水平，可以有效地抑制吗啡上瘾。我们证明，经过整合 RVG 短肽的经过改造的外泌小体可以有效地将 siRNA 递送到中枢神经系统中，并通过下调 受体的表达水平治疗阿片类药物上瘾。我们的研究提供了治疗药物上瘾和治疗中枢神经系统疾病的一种新的思路。关键词：外泌囊泡、 阿片类受体、小干扰核糖核酸、核糖核酸干
3、扰- 3 -本科生毕业论文（设计、作品）英文摘要Targeted Exosome-mediated Delivery of Opioid Receptor Mu siRNA for the Treatment of Morphine Relapse ABSTRACT：Cell-derived microvesicles (MVs) have been demonstrated to be efficient carriers of small RNAs to neighbouring or distant cells, highlighting the preponderance of MVs
4、 as carriers for gene therapy over other artificial delivery tools. In the present study, we employed modified exosomes expressing the neuron-specific rabies viral glycoprotein (RVG) peptide on the membrane surface to deliver opioid receptor mu (MOR) siRNA into the brain to treat morphine addiction.
5、 We found that MOR siRNA could be efficiently packaged into RVG exosomes and was associated with argonaute 2 (AGO2) in exosomes. These exosomes efficiently and specifically delivered MOR siRNA into Neuro2A cells and the mouse brain. Functionally, siRNA-loaded RVG exosomes significantly reduced MOR m
6、RNA and protein levels. Surprisingly, MOR siRNA delivered by the RVG exosomes strongly inhibited morphine relapse via the down-regulation of MOR expression levels. In conclusion, our results demonstrate that targeted RVG exosomes can efficiently transfer siRNA to the central nervous system and media
7、te the treatment of morphine relapse by down-regulating MOR expression levels. Our study provides a brand new strategy to treat drug relapse and diseases of the central nervous system.KEY WORDS: exosome, opiate receptor, siRNA, RNAi- 4 -目录第一章 研究背景综述 .11.1 毒品背景概述 .11.2 RNAi 背景介绍 .41.2.1 miRNA 内容概述 .4
8、1.2.2 RNAi 内容概述 .71.3 exosome 背景介绍 .81.3.1 exosome 的分类与性质 .81.3.2 exosome 与 RNA 的相互作用 .101.3.3 exosome 摄入 RNA 的机理 .111.3.4 exosome 的靶向性改造 .11第二章 实验部分 .132.1 exosome 包裹 siRNA 效率测试 .132.1.1 实验材料： .132.1.2 实验方法： .132.1.3 实验结果： .142.1.4 分析： .142.2 exosome 靶向性实验 .142.2.1 exosome 体外靶向性实验 .152.2.2 exosome
9、体内靶向性实验 .202.3 exosome 功能性研究 .252.3.1 exosome 体外功能性研究 .252.3.2 exosome 体内功能性研究 .27- 5 -2.4 实验讨论 .31参考文献 .I本科期间发表的成果 .VI致谢 .VII附录 .VIII1第一章 研究背景综述1.1 毒品背景概述毒品问题一直是全世界人类面临的重大问题。毒品问题既是犯罪问题，也是经济问题和科学问题。日趋严重的毒品问题已经成为全球性的灾难。目前全世界每年的毒品交易额高达 5000 亿美元以上，全世界吸食各种毒品的人数高达 2.42 亿人，其中 17-35 周岁的青壮年占 78%1。毒品的种类有很多。从
10、毒品的来源来看，可以分为天然毒品，合成和半合成毒品。毒品是指鸦片、海洛因、甲基苯丙胺（冰毒） 、吗啡、大麻、可卡因以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的麻醉药品和精神药品。其中最常见的是麻醉药品类中的大麻类、鸦片类和可卡因类2。目前对人类社会危害最大的是鸦片类毒品，尤其是海洛因和吗啡。海洛因（Heroin）化学名 “二乙酰吗啡” ，俗称白粉或者白面。海洛因镇痛效果是吗啡的 4-8 倍，医学上曾广泛用于麻醉镇痛，但成瘾快，极难戒断。长期使用会破坏人的免疫功能，并导致心、肝、肾等主要脏器损伤。历史上海洛因也曾被用做精神药品戒断吗啡，但由于副作用过大，最终被定为毒品。吗啡是罂粟提取物中具有药理活性
11、的主要生物碱，是一种历史悠久，疗效卓著的镇痛药物，其使用时间已达 4000 年以上。但由于吗啡可致快感而且极其容易依赖成瘾，并且由于吗啡及其化学合成衍生物海洛因的滥用，吗啡成瘾性已经成为全球关注的医学和社会问题。吗啡使用达到一定剂量时可以使机体成瘾。成瘾性又称精神依赖性，是一种反映心理异常的行为表现，其特点是纯粹以追求精神享受为用药目的，不择手段和不由自主地渴望得到药物；用药后可以获得一种特殊的心满意足的“快2感” ，从而根深蒂固地在心理上形成了对阿片类镇痛药的依赖，用药目的与疼痛治疗无关。有关阿片类毒品戒断综合征机理的研究，虽有进展，但目前仍尚未完全明了。阿片类药物可引起细胞信使传导系统的改
12、变，包括阿片受体脱敏和下调及与 G 蛋白偶联、不同亚基 G 蛋白的上调或下调、腺苷酸环化酶活性的变化、转录因子的激活等，尤其是兴奋性氨基酸（EEA） 、 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体、Ca 2+、一氧化氮（ NO）和环鸟苷酸（ cGMP） ，在吗啡依赖形成及产生戒断综合征中起十分重要的作用3。阿片类受体是介导内源性阿片肽及阿片类镇痛药物发挥作用的受体。目前已知有 5 种阿片类受体，编号分别为 、。在脑中至少存在、 3 种阿片受体参与阿片类药物的依赖成瘾。对于成瘾性， 受体起主要作用， 和 受体与成瘾性有关。吗啡引起神经兴奋的机理正常情况下，阿片受体以及阿片肽系统通过各种复杂的神经体液
13、机制调节3着体内众多的神经递质、调质以及内分泌的作用，保持着体内各系统之间的功能平衡。有研究表明，外源性阿片刺激 受体转化为结构活化状态。在经过阿片类药物处理后，活化 受体上调及 cAMP 系统上调，可增加腺苷酸环化酶（AC）和蛋白激酶 A（PKA）活性。停用阿片类药物后，导致一个自发的 cAMP 迅速而大幅度增高的调节过程。因此，在外源性阿片类药物进入机体，作用于阿片类受体及阿片肽系统引起一系列适应性变化，以建立新的平衡机制。阿片受体是 G 蛋白偶联受体，可以通过多种第二信使介导神经性蛋白质磷酸化，结果产生一系列神经生理功能依赖成瘾的变化。G 蛋白和 cAMP 系统的变化部分体现于其基于的表
14、达水平，阿片类药物的急性作用可使蓝斑神经元中的 c-los 基因表达水平下降，c-los 及其相关基因转录因子水平降低在吗啡依赖性变化中起重要作用。若长期作用保持在该水平，使用纳曲酮激发戒断症状时，c-los 和 c-jun 基因表达水平数倍增大。阿片类药物通过抑制电压敏感性 Ca2+通道，阻止 Ca2+内流，从而使神经元细胞内 Ca2+含量下降，并维持低水平，从而抑制神经元细胞放电，机体则表现为出现耐药。一旦突然停止给药或应用拮抗剂则迅速提高细胞内 Ca2+水平，从而出现高度兴奋，增加了神经递质的释放，出现了戒断综合征。41.2 RNAi 背景介绍1.2.1 miRNA 内容概述1.2.1.
15、1 miRNA 的发现过程1993 年 Lee 等人在对秀丽线虫（Celegans ）的突变体进行遗传分析时，发现了第一个 miRNA 基因lin4，这一基因虽然不编码任何蛋白，却可以通过产生一对小 RNA 调控线虫幼虫的发育。一个 RNA 大约 22 个 nt，另一个大约66 个 nt。较长的一个 nt 被认为是可以折叠成发夹结构，并且认为是较短的那个RNA 的前体。他把长度约为 22 个 nt 的 RNA，叫 lin-4 RNA。lin-4 RNA 会使lin-14 基因沉默，其功能是使发育事件延迟，因此 lin-4 基因的突变会使线虫中许多应该在早期出现的发育事件延迟发生4。并且，lin
16、-4 基因活性水平的降低仅 d 导致蛋白水平降低，其转录水平没有变化4。这种现象表明可能存在一种特殊的调控机制影响了 lin-4 mRNA 的活性。后来证明，这种负调控机制正是由lin-4 编码的小 RNA 片段执行的，这段长度仅仅 21 nt 的 RNA 通过与 lin-4 mRNA 的 3-untranslated region（3-UTR）的不完全互补，影响 lin-4 mRNA 的翻译，当时的研究者称之为小分子时序 RNA（small temporal RNA，stRNA）5-7。miRNA 前体及成熟体示意图随后的几年时间里科学家对 miRNA 的研究不断加深，应用随机克隆和测序、生
17、物信息学预测的方式，又分别在人类、小鼠、大鼠、果蝇、斑马鱼、拟南芥等生物物种发现了成千种 miRNAs。被鉴定的 miRNAs 均被 miRBase 网站5整理并加以注释8-10。此网站由著名的 Sanger 研究所主办，并对公众开放。（http:/microrna.sanger.ac.uk/） 。到 2011 年 11 月，miRBase 数据库已更新到18.0 版本,共发布 168 个物种的 18226 种发夹前体 miRNA，表达 21643 种成熟miRNA。microRNA 参与生命过程中一系列的重要过程，包括早期的胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢和细胞分化等等，在生命过程中起
18、着非常重要的作用。1.2.1.2 miRNA 的成熟过程经过数十年的研究，人们对 microRNA 在体内的成熟过程已经十分了解7-11。(1) 首先，miRNA 由 RNA 聚合酶（Pol II）转录生成一个大小约为 1000bp的长链 RNA 转录产物，即 pri-miRNA（primary miRNA） 。(2) 然后，在细胞核中，内切核酸酶 RNase型蛋白 Drosha 在 pri-miRNA 分子基部切割双链形成 60-100bp 的 5末端具有磷酸基、3末端具有二核苷酸突出（over-hang ）的茎环中间体，即 miRNA 的前体分子（precursor miRNA，pre-m
19、iRNA） 。(3) 然后，转运蛋白 Exportin-5 通过识别 pre-miRNA 的 3端的二核苷酸突出信号而与 pre-miRNA 结合，依赖 Ran-GTP 将 pre-miRNA 输出到细胞质。植物中是由 Exportin-5 的同源物 HASTY 负责 miRNA 前体的输出。(4) 之后，另一个内切核酸酶 RNase型蛋白 Dicer 识别 pre-miRNA 双链的5末端磷酸及 3末端突出，在距茎环大约两个螺旋转角处切断螺旋体的双链，产生一个结构类似于 siRNA 的长为 19-23 个核苷酸的小分子双链 RNA（miRNA:miRNA* duplex） ，其中成熟的 miRNA 来自于 pre-miRNA 的一条臂，pre-miRNA 的另外一条臂产生一个长度与 miRNA 相
