1、名词解释生物技术、RAPD、酶单位、载体、质粒、基因工程，退火，基因组文库，cDNA 文库，PCR，转化，DNA 甲基化，RFLP，ISSR ，植物基因工程，感受态细胞，受体细胞，工具酶、YAC、探针、AFLP、基因芯片、质粒、基因治疗、基因打靶、基因疗法、原位杂交、分子标记、核酸分子杂交选择题（单选和多选）1、第一个作为重组 DNA 载体的质粒是( )(a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl82、型限制性内切核酸酶( )(a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列(b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供(c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列
2、(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性(e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供3、在下列试剂中，那一种可以螯合 Ca2+离子( )(a)EDTA (b)柠檬酸钠 (c)SDS (d)EGTA4、同一种质粒 DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是( )(a)OCDNASCDNALDNA (b)SCDNALDNAOCDNA(c)LDNAOCDNASCDNA (d)SCDNAOCDNALDNA5、黏粒(cosmid) 是一种人工建造的载体( )(a)它具有 COS 位点，因而可进行体外包装 (b)它具有质粒 DNA 的复制特性(c)进入受体细胞后，可引起裂解反应 (d)进入受
3、体细胞后，可引起溶源化反应6、用碱法分离质粒 DNA 时，染色体 DNA 之所以可以被除去，是因为( )(a)染色体 DNA 断成了碎片 (b)染色体 DNA 分子量大，而不能释放(c)染色体变性后来不及复性 (d)染色体未同蛋白质分开而沉淀7、根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA 文库等。在下列文库中( )属 cDNA 文库(a) YAC 文库 (b) MAC 文库 (c) 扣减文库 (d) BAC 文库8、关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确( )(a)具有可诱导性 (b)具有可转移性(c)细菌生长的任何时期都可以出现 (d)不同细菌出现感受态的比例是不同的9、在
4、利用 lacZ 失活的显色反应筛选法中， IPTG 的作用是( )(a)诱导宿主的 肽的合成 (b)诱导宿主的 肽的合成(c)作为酶的作用底物 (d)作为显色反应的指示剂10、基因工程发展史上理论上的三个重要发现是（ ）(a) DNA 的发现 (b)DNA 双螺旋结构和半保留复制机理的建立 (c)遗传信息传递方式（中心法则） (d)限制性内切酶和 DNA 连接酶的发现(e)载体的使用 (f)基因的体外重组3、在下列进行 DNA 部分酶切的条件中，控制那一项最好?( )(a)反应时间 (b)酶量 (c)反应体积 (d)酶反应的温度4、下列哪种克隆载体对外源 DNA 的容载量最大?( )(a)质粒
5、 (b)黏粒 (c)酵母人工染色体(YAC) (d) 噬菌体 (e) cDNA 表达载体 5、黏粒(cosmid) 是一种人工建造的载体，( )(a)它具有 COS 位点，因而可进行体外包装 (b)它具有质粒 DNA 的复制特性 (c)进入受体细胞后，可引起裂解反应(d)进入受体细胞后，可引起溶源化反应6、关于碱解法分离质粒 DNA，下面哪一种说法不正确?( )(a)溶液 I 的作用是悬浮菌体 (b)溶液的作用是使 DNA 变性(c)溶液的作用是使 DNA 复性(d)质粒 DNA 分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性7、cDNA 文库包括该种生物的( )(a)某些蛋白质的结构基因 (b)
6、所有蛋白质的结构基因(c)所有结构基因 (d)内含子和调控区8、Southern 印迹是用 DNA 探针检测 DNA 片段，而 Northern 印迹则是：( )(a)用 RNA 探针检测 DNA 片段 (b)用 RNA 探针检测 RNA 片段(c)用 DNA 探针检测 RNA 片段 (d)用 DNA 探针检测蛋白质片段9、同一种质粒 DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：( )(a)OCDNASCDNALDNA (b)SCDNALDNAOCDNA(c)LDNAOCDNASCDNA (d)SCDNAOCDNALDNA10、在基因工程中，可用碱性磷酸酶( )(a)防止 DNA
7、的自身环化 (b)同多核苷酸激酶一起进行 DNA 的 5，末端标记 (c)制备突出的 3，末端 (d)上述说法都正确简答题质粒作为理想的基因工程载体应具备哪些特点？在提取 DNA 的过程中，用无水乙醇和异丙醇均可沉淀 DNA 有什么区别？在碱法提取质粒的过程中应注意哪些问题？与其他转基因方法相比，基因枪法有哪些优点？ 如果一个 DNA 酶解液在电泳后发现 DNA 未被切动，你认为可能是什么原因。基因工程的研究内容是什么？基因组文库与 cDNA 文库有何区别？PCR 引物设计的原则是什么？基因工程操作要求受体细胞应该具备哪些特点？简述农杆菌介导的基因转化的特点及其在基因转化过程中的影响因素？植物
8、基因转化受体建立中常常会遇到哪些问题？基因工程的基本操作程序包括哪几部分内容？基因组文库与 cDNA 文库有何区别？影响凝胶电泳的因素有哪些？采用 CTAB 法提取植物基因组 DNA 的基本原理是什么？限制性内切酶的活性受哪些因素影响？理想的分子标记必须达到的要求是什么？CTAB 和 SDS 法提取核酸的原理各是什么？如何对转基因植株进行检测？制备目的基因片段的途径有哪些？什么是 cDNA 文库(complementDNAlibrary)? 同基因组文库有何差别 ?列举质粒载体必须具备的几个基本特性。什么是 Western 印迹? 它与 Southern 印迹有什么不同?分子标记有哪几种类型？
9、YAC 载体具有什么样的功能性 DNA 序列？为什么在克隆大片段时， YAC 具有优越性？论述题、如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你如何解释这种现象？请论述植物基因工程在农业上的应用的研究进展前景根据所学的知识，论述农杆菌介导的基因转化和基因枪转化法两种方法的基本原理以及在农业生产上的应用。请详述 PCR 技术的原理、种类以及在生产实际中的应用情况。利用学过的知识设计一个植物基因转化的试验方案根据所学知识列出两个 PCR 使用过程中常发生的问题，并提出解决方案。目前，许多目的基因的产物是未知的，特别是建立在遗传表型分析基础上的目的基因，试述克隆这些产物未知的目的基因的策略
10、是什么，并简要介绍一下其基本原理。如何以大肠杆菌质粒 DNA 为载体克隆一个编码植物激素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。一、名词解释一、填空题(20 分，每个 4 分)转化：是指将外源 DNA 引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。DNA 的物理图谱：是指 DNA 链的限制性酶切片段的排列顺序，即酶切片段在 DNA 链上的定位。因限制性内切酶在 DNA 链上的切口是以特异序列为基础的,核苷酸序列不同的 DNA，经酶切后就会产生不同长度的 DNA 片段,由此而构成独特的酶切图谱。因此
11、，DNA 物理图谱是 DNA 分子结构的特征之一。酶单位：反映某一特定条件下，使单位时间内反应物的变化量达到某一程度所需要的酶量。酶单位都是以酶活力为根据而定义的。载体：把一个有用的目的基因 DNA 片段通过重组 DNA 技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。目前使用的载体主要有四大类：质粒，噬菌体 、单链噬菌体和粘粒。质粒：是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从 1-200kb 不等，为双链、闭环的 DNA 分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。二、填空题：1、变性
12、、退火、延伸2、双链环状 DNA，线状 DNA，超螺旋状 DNA3、CTAB核酸复合物，CTAB核酸复合物，残留 RNA4、火药爆炸力型、高压气体动力型、高压放电动力型5、凝胶浓度，DNA 分子的大小和构象，电泳缓冲液、指示剂、染色6、电荷、分子大小及形状二、简答题：（每题 5 分，共 30 分）1、质粒作为理想的基因工程载体应具备哪些特点？（1）一个复制起点（2）可选择的标记，是鉴定细胞是否携带载体所必需的。（3）合成的单一限制酶酶切位点（4）插入标记，是用来观察外源基因是否插入。（5）合适的大小，质粒应该相对的小，小质粒不易受物理损伤，而且限制酶的酶切图谱较简单，另外，小质粒一般具有较高的
13、拷贝数。（6）高拷贝数，基因工程应该选择具有高拷贝数的松弛型的质粒为载体。不同的质粒有不同的拷贝数。 （7）不易丢失2在提取 DNA 的过程中，用无水乙醇和异丙醇均可沉淀 DNA 有什么区别？在提取 DNA 的过程中，利用无水乙醇和异丙醇均可沉淀 DNA，但它们之间是有区别的：沉淀 DNA 通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使 DNA 沉淀完全，而且沉淀的多数是大片段的 DNA。利用冰冷的异丙醇(一般用等体积)也可沉淀 DNA，而且沉淀速度快，沉淀完全，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。3、在碱法提取质粒的过程中应注意哪些问题？(1) 整个过程都需要在低温下操作(2) 加入溶液 I
14、I 和溶液 III 后操作应混和，切忌剧烈振荡。(3) 在提取的过程中应该保持动作温和，不要剧烈振荡(4) 提取过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。4、与其他转基因方法相比，基因枪法有哪些优点？与其它遗传转化方法相比较，有以下优点：A、 无宿主限制：根癌农杆菌只对某些双子叶植物敏感，而对多数单子叶植物尤其是重要的禾谷类作物不敏感，从而大大限制了它的应用范围。基因枪技术没有物种限制，对双子叶和单子叶植物都可适用，对动物、微生物也同样适用。B、 靶受体类型广泛：PEG 法、脂质体法、电击法等介导基因转化需要以原生质体作为受体细胞。由于原生
15、质体不易培养和再生，或再生周期长，基因型依赖性强，使这些方法的应用受到限制。基因枪技术可以选用易于再生的受体，绕过原生质体再生的困难。它不仅以原生质体、叶圆基为靶受体，而且悬浮培养细胞、茎或根切段以及种子胚、分生组织、幼穗、幼胚、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有潜在分生能力的中组织或细胞都可以用基因枪进行轰击转化。C、 可控度高：近代的高压放电或高压气体基因枪已可根据实验需要无级调控微弹的速度和射入浓度，可以较高的命中率把 DNA 微粒载体射入特定层次的细胞，即厂家态细胞和分生区细胞，从而为基因转化提供可靠的技术措施D、 操作简便快速，甚至可克服无菌的困难5、如果一个 DNA 酶解液在电
16、泳后发现 DNA 未被切动，你认为可能是什么原因。可能的原因是：(1) 所加的限制性酶已失活，(2) DNA 片段结构的特殊性，对酶要求高，或相对应的酶切位点很少(3) 电泳时所加的电极缓冲液的离子强度太大使 DNA 分离不明显，或者是离子强度太小，使 DNA 没有泳动。(4) 琼脂糖的浓度没有控制好，(5) 有外来 DNA 的污染三、为了提高转化效率，实验中要考虑哪几个方面的因素（15 分） 。(1) 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于 4 度冰箱的培养菌。最好多-70 度或-20 度甘油中保存的菌种中直接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期为好，可通过监测培养
17、液的 OD600 来控制。(2) 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒 DNA 主要是超螺旋状态 DNA(cccDNA)。转化效率和外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%。(3) 试剂的质量：所用的试剂，均需是最高纯度的(GR 或 AR)，并用超水配制，最好分装于干燥的冷暗处。(4) 防止杂菌和杂 DNA 的污染：整个操作过程均需在无菌条件下进行，所用器皿如离心管最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 DNA 所污染，否均会影
18、响转化效率或杂 DNA 的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。四、如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你如何解释这种现象？（15 分）在实验过程中对照组不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，这种现象的可能原因是：(1) 操作过程仪器、器皿等不是无菌的，出现了一些杂菌和杂 DNA 的污染(2) 细菌在感受态时发生了一些自然变异，对所加的抗生素有一定的抗性，所以长出一些菌落(3) 所加的抑菌抗生素浓度不够，不能够抑制住细菌的生长(4) 一些实验误差，错将菌液放错五、假如用高效液相色谱分析内源植物激素，应从哪些方面考虑提高结果的准确性？（20） 可从样品的制备、高效液相色谱柱的
19、选择、流动相的选择、分离条件的选择及操作过程等六个方面来考虑：(1) 植物内源激素的提取：提取所用的试剂，即提取液的配比要达到最适，使提取物能够达到较高的纯度，并且在操作过程中力求准确，离心的条件，离心机的转数要调整到最适范围。(2) 植物内源激素的纯化：A 纯化可用离子层析法，一般选用磷酸纤维素阳离子柱效果最好，离子层析过程中，需选择合适的洗脱液，控制好洗脱液的流速，洗脱液收集的最适范围，每种激素的洗脱液的体积都要估计准确。B 高效液相色谱分析中要注意的是：1) 溶剂的纯化：一般选择“色谱纯”的溶剂，如甲醇、乙腈等作为溶剂，必要时需进行纯化操作，不纯的溶剂会使色谱柱堵塞，且直接影响分析结果。
20、2) 流动相的选择：一般用甲醇、乙腈等与水配比形成流动相，要求流动相在检测波长下无背景吸收3) 流动相的配比：根据分析样品的不同，正确配比有机溶剂与水的游动相，使样品能在检测波长下有最大吸收，而流动相无背景吸收峰4) 脱气：气泡的存在会使流动相流速减慢，延长保留时间，同时会堵塞色谱柱，影响检测结果。5) 样品过滤：样品在进样前需进行过滤，脱气，除去杂质，防止杂质干扰，而出现吸收峰6) 色谱条件：主要是选择最佳紫外波长，使该波长下样品有最大吸收峰，而流动相无背景吸收峰7) 标准曲线的绘制：标样的配制与检测，以及标准曲线的绘制力求准确8) 时，微量注射器中需装定量管体积的 3 倍以上的样品，定量要准确，否则会影响分析结果。9) 计算过程：数据的处理也要做到准确无误。
