1、1. 生 物 技 术 制 药 分 为 哪 些 类 型 ？生 物 技 术 制 药 分 为 四 大 类 ：（ 1） 应 用 重 组 DNA 技 术 (包 括 基 因 工 程 技 术 、 蛋 白 质 工 程 技 术 )制 造 的 基 因 重组 多 肽 ， 蛋 白 质 类 治 疗 剂 。（ 2） 基 因 药 物 ， 如 基 因 治 疗 剂 ， 基 因 疫 苗 ， 反 义 药 物 和 核 酶 等（ 3） 来 自 动 物 、 植 物 和 微 生 物 的 天 然 生 物 药 物（ 4） 合 成 与 部 分 合 成 的 生 物 药 物2 生 物 技 术 制 药 具 有 什 么 特 征 ？（ 1） 分 子 结
2、构 复 杂（ 2） 具 有 种 属 特 异 性（ 3） 治 疗 针 对 性 强 ， 疗 效 高（ 4） 稳 定 性 差（ 5） 基 因 稳 定 性（ 6） 免 疫 原 性（ 7） 体 内 的 半 衰 期 短（ 8） 受 体 效 应（ 9） 多 效 性（ 10） 检 验 的 特 殊 性3.生 物 技 术 制 药 中 有 哪 些 应 用 ？应 用 主 要 有 ：（ 1） 基 因 工 程 制 药 ： 包 括 基 因 工 程 药 物 品 种 的 开 发 ， 基 因 工 程 疫 苗 ， 基 因 工 程 抗 体 ，基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 ， 应 用 基 因 工 程 技 术 建 立 新 药 的
3、筛 选 模 型 ， 应 用 基 因 工 程技 术 改 良 菌 种 ， 产 生 新 的 微 生 物 药 物 ， 基 因 工 程 技 术 在 改 进 药 物 生 产 工 艺 中的 应 用 ， 利 用 转 基 因 动 植 物 生 产 蛋 白 质 类 药 物（ 2） 细 胞 工 程 制 药 ： 包 括 单 克 隆 抗 体 ， 动 物 细 胞 培 养 ， 植 物 细 胞 培 养 生 产 次 生 代 谢产 物（ 3） 抗 体 工 程 制 药（ 4） 酶 工 程 制 药（ 5） 发 酵 工 程 制 药4.基 因 工 程 药 物 制 造 的 主 要 程 序 有 哪 些 ？基 因 工 程 药 物 制 造 的 主
4、 要 步 骤 有 ： 目 的 基 因 的 克 隆 ， 构 造 DNA 重 组 体 ， 构 造 工 程 菌 ， 目 的 基 因 的 表 达 ， 外 源 基 因 表 达 产 物 的 分 离 纯 化 产 品 的 检 验5.影 响 目 的 的 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 的 因 素 有 哪 些 ？（ 1） 外 源 基 因 的 计 量（ 2） 外 源 基 因 的 表 达 效 率 ： a、 启 动 子 的 强 弱 b、 核 糖 体 的 结 合 位 点 c、 SD 序 列 和 起 始 密 码 的 间 距 d、 密 码 子 组 成（ 3） 表 达 产 物 的 稳 定 性（ 4） 细 胞 的 代 谢
5、 付 荷 （ 5） 工 程 菌 的 培 养 条 件6.质 粒 不 稳 定 分 为 哪 两 类 ， 如 何 解 决 质 粒 不 稳 定 性 ？质 粒 不 稳 定 分 为 分 裂 不 稳 定 和 结 构 不 稳 定 。质 粒 的 分 裂 不 稳 定 是 指 工 程 菌 分 裂 时 出 现 一 定 比 例 不 含 质 粒 的 子 代 菌 的 现 象 ；质 粒 的 结 构 不 稳 定 是 DNA 从 质 粒 上 丢 失 或 碱 基 重 排 ， 缺 失 所 致 工 程 菌 性 能 的 改 变 。提 高 质 粒 稳 定 性 的 方 法 如 下 ：（ 1） 选 择 合 适 的 宿 主 细 菌（ 2） 选 择
6、 合 适 的 载 体（ 3） 选 择 压 力（ 4） 分 阶 段 控 制 培 养（ 5） 控 制 培 养 条 件（ 6） 固 定 化7.影 响 基 因 工 程 菌 发 酵 的 因 素 有 哪 些 ？ 如 何 控 制 发 酵 的 各 种 参 数 ？影 响 因 素 ：（ 1） 培 养 基（ 2） 接 种 量（ 3） 温 度（ 4） 溶 解 氧（ 5） 诱 导 时 机 的 影 响（ 6） 诱 导 表 达 程 序（ 7） PH 值8.什 么 是 高 密 度 发 酵 ？ 影 响 高 密 度 发 酵 的 因 素 有 哪 些 ？ 可 采 取 哪 些 方 法 来 实 现 高 密 度 发 酵 ？高 密 度 发
7、酵 ： 是 指 培 养 液 中 工 程 菌 的 菌 体 浓 度 在 50gDCW/L 以 上 ， 理 论 上 的 最 高 值 可达 200gDCW/L影 响 因 素 ： （ 1） 培 养 基 （ 2） 溶 氧 浓 度 （ 3） PH (4)温 度 （ 5） 代 谢 副 产 物实 现 高 密 度 发 酵 的 方 法 ：（ 1） 改 进 发 酵 条 件 ： a、 培 养 基 b、 建 立 流 加 式 培 养 基 c、 提 高 供 养 能 力（ 2） 构 建 出 产 乙 酸 能 力 低 的 工 程 菌 宿 主 菌 ： a、 阻 断 乙 酸 产 生 的 主 要 途 径 b、 对 碳 代 谢 流 进 行
8、 分 流 c、 限 制 进 入 糖 酵 解 途 径 的 碳 代 谢 流 d、 引 入 血 红 蛋 白基 因（ 3） 构 建 蛋 白 水 解 酶 活 力 低 的 工 程 化 宿 主 菌9.分 离 纯 化 常 用 的 色 谱 分 离 方 法 有 哪 些 ?它 们 的 原 理 是 什 么 ?方 法 有 离 子 交 换 色 谱 、 疏 水 色 谱 、 反 相 色 谱 、 亲 和 色 谱 、 凝 胶 过 滤 色 谱 及 高 压 液 相 色谱 。（ 1） 离 子 交 换 色 谱 IEC： 是 以 离 子 交 换 剂 为 固 定 相 ， 依 据 流 动 相 中 的 组 分 离子 与 交 换 剂 上 的 平
9、衡 离 子 进 行 可 逆 交 换 时 的 结 合 力 大 小 的 差 别 而 进 行 分 离 的 一 种 层析 方 法 。（ 2） 疏 水 层 析 HIC： 是 利 用 蛋 白 质 表 面 的 疏 水 区 与 固 定 相 上 疏 水 性 基 团 相 互作 用 力 的 差 异 ， 对 蛋 白 质 组 进 行 分 离 的 层 析 方 法 。（ 3） 亲 和 层 析 AC： 是 利 用 固 定 化 配 体 与 目 的 蛋 白 质 之 间 的 非 常 特 异 的 生 物 亲和 力 进 行 吸 附 ， 这 种 结 合 既 是 特 异 的 ， 又 是 可 逆 的 ， 改 变 条 件 可 以 使 这 种
10、结 合 解 除 。（ 4） 凝 胶 过 滤 层 析 ： 以 多 孔 性 凝 胶 填 料 为 固 定 相 ， 按 分 子 大 小 对 溶 液 中 各 组分 进 行 分 离 的 液 相 层 析 方 法 。10.对 由 基 因 重 组 技 术 所 获 得 的 蛋 白 质 药 物 进 行 鉴 定 时 ， 常 做 哪 些 项 目 分 析 ？基 因 工 程 药 物 质 量 控 制 主 要 包 括 以 下 几 点 ： 产 品 的 鉴 别 ， 纯 度 ， 活 性 ， 安 全 性 ， 稳定 性 和 一 致 性项 目 分 析 主 要 有 ：（ 1） 生 物 活 性 测 定（ 2） 理 化 性 质 鉴 定（ 3）
11、蛋 白 质 含 量 鉴 定（ 4） 蛋 白 质 纯 度 分 析（ 5） 杂 志 检 测（ 6） 稳 定 性 考 察（ 7） 产 品 一 致 性 的 保 证11.离 体 培 养 的 动 物 细 胞 分 为 哪 些 类 型 ?分 为 三 类 ：（ 1） 贴 壁 细 胞 ： 细 胞 生 长 必 须 有 可 以 贴 附 的 支 持 物 表 面 ， 细 胞 依 靠 自 身 分 泌的 培 养 基 中 提 供 的 贴 附 因 子 才 能 在 该 表 面 上 生 长 增 殖 。（ 2） 悬 浮 细 胞 ： 细 胞 的 生 长 不 依 赖 支 持 物 表 面 ， 可 在 培 养 液 中 悬 浮 状 态 生 长（
12、 3） 兼 性 贴 壁 细 胞 ： 既 可 贴 附 于 支 持 物 表 面 生 长 ， 又 在 悬 浮 生 长 。12.生 产 用 的 动 物 细 胞 有 哪 些 种 类 ？ 它 们 各 有 什 么 特 点 ？答 ： （ 1） 生 产 用 的 动 物 细 胞 的 种 类 ： 原 代 细 胞 系 、 二 倍 体 细 胞 系 、 转 化 细 胞 、 融 合 细 胞系 、 重 组 工 程 细 胞 系（ 2） 它 们 各 自 的 特 点 ：（ A） 二 倍 体 细 胞 系 的 特 点 ： 染 色 体 组 型 仍 然 是 2n 的 核 型 具 有 明 显 的 贴 壁 依 赖 和 接 触 抑 制 的 特
13、性 只 有 有 限 的 增 值 能 力 ， 一 般 可 连 续 传 代 培 养 50 代 物 致 瘤 性（ B） 转 化 细 胞 系 的 特 点 ： 具 有 无 限 生 命 力 倍 增 时 间 较 短 对 培 养 条 件 和 生 长 因 子 等 要 求 较 低（ C） 融 合 细 胞 系 的 特 点 ： 可 使 不 同 的 动 物 和 动 物 细 胞 融 合 可 是 动 物 和 植 物 细 胞 融 合13.常 用 的 培 养 动 物 细 胞 的 培 养 基 的 种 类 有 哪 些 ？（ 1） 天 然 培 养 基（ 2） 合 成 培 养 基（ 3） 无 血 清 培 养 基14.如 何 进 行 动
14、 物 细 胞 大 规 模 培 养 ？大 规 模 培 养 的 方 法 ：（ 1） 悬 浮 细 胞（ 2） 贴 壁 细 胞（ 3） 贴 壁 悬 浮 细 胞 ： a、 微 载 体 培 养 b、 包 埋 和 微 囊 培 养 c、 结 团 培养大 规 模 培 养 的 操 作 方 式 ：（ 1） 分 批 式 操 作 ； （ 2） 半 连 续 式 操 作 ； （ 3） 灌 流 式 操 作15.动 物 细 胞 生 物 反 应 器 必 须 具 备 哪 些 基 本 要 求 ？ 有 哪 些 类 型 ？ 特 定 是 什 么 ？动 物 细 胞 反 应 器 具 备 的 基 本 要 求 ：（ 1） 制 造 生 物 反 应
15、器 所 采 用 的 一 切 材 料 ， 尤 其 是 与 培 养 基 ， 细 胞 直 接 接触 的 材 料 ， 对 细 胞 必 须 是 无 毒 性 的 。（ 2） 生 物 反 应 器 的 结 构 必 须 使 之 具 有 良 好 的 传 质 、 传 热 和 混 合 的 性 能（ 3） 密 封 性 良 好 ， 可 避 免 一 切 外 采 的 不 需 要 的 微 生 物 污 染 。（ 4） 对 培 养 基 环 境 中 多 种 物 理 化 学 参 数 能 自 动 检 测 和 调 节 控 制 ， 控 制 的精 度 高 ， 而 且 能 保 持 环 境 质 量 的 均 一 。（ 5） 可 长 期 连 续 运
16、转 ， 这 对 于 培 养 动 物 细 胞 的 生 物 反 应 器 显 得 尤 其 重 要 。（ 6） 容 器 加 工 制 造 时 要 求 内 面 光 滑 ， 无 死 角 ， 以 减 少 细 胞 或 微 生 物 的 沉积 。（ 7） 拆 装 ， 连 结 和 清 洁 方 便 ， 能 耐 高 压 蒸 汽 消 毒 ， 便 于 操 作 维 修（ 8） 设 备 成 本 尽 可 能 低 。反 应 器 类 型 及 特 点 ：（ 1） 搅 拌 罐 式 生 物 反 应 器 ： 主 要 用 于 是 悬 浮 细 胞 培 养 ， 微 载 体 培 养 ， 微囊 和 巨 载 体 培 养 以 及 结 团 培 养（ 2） 气
17、 升 式 生 物 反 应 器 ： 气 体 通 过 装 在 罐 底 的 喷 管 进 入 反 应 器 的 导 流管 ， 致 使 该 部 液 体 的 密 度 小 于 导 流 管 外 部 的 液 体 形 成 循 环 流 。（ 3） 中 空 纤 维 式 生 物 反 应 器 ： 占 地 空 间 小 ， 产 品 产 量 、 质 量 高 ， 生 产 成本 低 ， 不 能 重 复 使 用 ， 不 能 耐 高 压 蒸 汽 灭 菌 ， 需 用 环 氧 乙 烷 或 其 它 消 毒 剂 灭 菌 ， 难以 取 样 检 测 。（ 4） 透 析 袋 或 膜 式 生 物 反 应 器 ： 可 使 细 胞 达 到 高 密 度 ，
18、又 可 随 意 组 合进 行 操 作 ， 对 产 品 进 行 浓 缩 纯 化 。（ 5） 固 定 床 或 流 化 床 生 物 反 应 器 ： 结 构 简 单 ， 装 填 材 料 易 得 。16.动 物 细 胞 制 药 有 哪 些 新 进 展 ？ 答 ： 改 进 表 达 载 体 ， 提 高 表 达 水 平 和 产 量 利 用 代 谢 工 程 改 进 培 养 工 艺 抑 制 细 胞 凋 亡 ， 延 长 培 养 周 期 采 用 糖 基 化 工 程 ， 提 高 产 品 质 量 转 基 因 动 物 的 研 究 组 织 工 程 研 究17.什 么 是 单 克 隆 抗 体 ？ 单 克 隆 抗 体 有 哪 些
19、 不 足 ？单 克 隆 抗 体 ： 是 针 对 一 个 抗 原 决 定 簇 的 抗 体 ， 又 是 单 一 的 B 淋 巴 细 胞 克 隆 产 生 的 抗 体 。不 足 ：（ 1） 单 克 隆 抗 体 均 是 鼠 源 性 抗 体 ， 应 用 于 人 体 内 可 产 生 人 抗 鼠 抗 体 ， 加 速 了 排斥 反 应 ， 在 人 体 内 半 衰 期 只 有 5-6h， 难 以 维 持 有 效 药 物 作 用 靶 组 织 时 间 。（ 2） 完 整 的 抗 体 分 子 ， 即 Ig 的 相 对 分 子 质 量 过 大 ， 难 以 穿 透 实 体 肿 瘤 组 织 ， 达不 到 有 效 治 疗 浓
20、度 。18 单 克 隆 抗 体 的 制 备 过 程 ： 制 备 抗 原 用 抗 原 免 疫 动 物 得 到 抗 体 提 取 小 鼠 B 淋 巴 细 胞 核 骨 髓 肿 瘤 细 胞 细 胞 融 合 杂 交 瘤 细 胞 的 选 择 培 养 杂 交 瘤 细 胞 的 筛 选 杂 交 瘤 细 胞 的 克 隆 化 单 克 隆 抗 体 的 鉴 定 单 克 隆 抗 体 的 纯 化19 基 因 工 程 抗 体 有 哪 些 类 型 ？ 其 特 性 和 制 备 方 法 有 什 么 不 同 ？答 ： 基 因 工 程 抗 体 主 要 包 括 嵌 合 抗 体 、 人 源 化 抗 体 、 完 全 人 源 抗 体 、 单 链
21、 抗 体 、 双 特 异 性抗 体 等 。（ 1） 嵌 合 抗 体 嵌 合 抗 体 （ chimeric atibody ） 是 最 早 制 备 成 功 的 基 因 工 程 抗 体 。 它是 由 鼠 源 性 抗 体 的 V 区 基 因 与 人 抗 体 的 C 区 基 因 拼 接 为 嵌 合 基 因 ， 然 后 插 入 载 体 ， 转染 骨 髓 瘤 组 织 表 达 的 抗 体 分 子 。 因 其 减 少 了 鼠 源 成 分 ， 从 而 降 低 了 鼠 源 性 抗 体 引 起 的 不 良反 应 ， 并 有 助 于 提 高 疗 效 。（ 2） 人 源 性 抗 体 是 将 人 抗 体 的 CDR 代
22、之 以 鼠 源 性 单 克 隆 抗 体 的 CDR ， 由 此 形 成 的 抗体 ， 鼠 源 性 只 占 极 少 ， 称 为 人 源 化 抗 体 。（ 3） 完 全 人 源 化 抗 体 采 用 基 因 敲 除 术 将 小 鼠 Ig 基 因 敲 除 ， 代 之 以 人 Ig 基 因 ， 然 后用 Ag 免 疫 小 鼠 ， 再 经 杂 交 瘤 技 术 即 可 产 生 大 量 完 全 人 源 化 抗 体 。（ 4） 单 链 抗 体 是 将 Ig 的 H 链 和 L 链 的 V 区 基 因 相 连 ， 转 染 大 肠 杆 菌 表 达 的 抗 体分 子 ， 又 称 单 链 FV （ single cha
23、in fragment of variable region,sFv ） 。 SFv 穿 透 力 强 ， 易 于 进 入 局 部 组 织 发 挥 作 用 。（ 5） 双 特 异 性 抗 体 将 识 别 效 应 细 胞 的 抗 体 和 识 别 靶 细 胞 的 抗 体 联 结 在 一 起 ， 制 成 双 功 能性 抗 体 ， 称 为 双 特 异 性 抗 体 。 如 由 识 别 肿 瘤 抗 原 的 抗 体 和 识 别 细 胞 毒 性 免 疫 效 应 细 胞 （ CTL 细 胞 、 NK 细 胞 、 LAK 细 胞 ） 表 面 分 子 的 抗 体 （ CD3 抗 体 或 CD16 抗 体 ） 制 成
24、的双 特 异 性 抗 体 ， 有 利 于 免 疫 效 应 细 胞 发 挥 抗 肿 瘤 作 用 。20.抗 体 治 疗 药 物 有 哪 些 ？（ 1） 放 射 性 同 位 素 标 记 的 抗 体 治 疗 药 物（ 2） 抗 癌 药 物 偶 联 的 抗 体 药 物（ 3） 毒 素 偶 联 的 抗 体 药 物21.抗 体 诊 断 试 剂 有 哪 些 类 型 ？（ 1） 血 清 学 鉴 定 用 的 抗 体 试 剂（ 2） 免 疫 标 记 用 的 抗 体 试 剂（ 3） 导 向 诊 断 药 物（ 4） CD 单 克 隆 抗 体 系 列22. 单 克 隆 抗 体 制 备 的 基 本 原 理 与 过 程 ？
25、 有 什 么 意 义 ？答 ： 原 理 ：B 淋 巴 细 胞 在 抗 原 的 刺 激 下 ， 能 够 分 化 、 增 殖 形 成 具 有 针 对 这 种 抗 原 分 泌 特 异 性 抗 体的 能 力 。 B 细 胞 的 这 种 能 力 和 量 是 有 限 的 ， 不 可 能 持 续 分 化 增 殖 下 去 ， 因 此 产 生 免 疫 球 蛋白 的 能 力 也 是 极 其 微 小 的 。 将 这 种 B 细 胞 与 非 分 泌 型 的 骨 髓 瘤 细 胞 融 合 形 成 杂 交 瘤 细 胞 ，再 进 一 步 克 隆 化 ， 这 种 克 隆 化 的 杂 交 瘤 细 胞 是 既 具 有 瘤 的 无
26、限 生 长 的 能 力 ， 又 具 有 产 生 特异 性 抗 体 的 B 淋 巴 细 胞 的 能 力 ， 将 这 种 克 隆 化 的 杂 交 瘤 细 胞 进 行 培 养 或 注 入 小 鼠 体 内 即 可获 得 大 量 的 高 效 价 、 单 一 的 特 异 性 抗 体 。 这 种 技 术 即 称 为 单 克 隆 抗 体 技 术 。过 程 ：1） 免 疫 脾 细 胞 的 制 备 ： 制 备 单 克 隆 抗 体 的 动 物 多 采 用 纯 系 Balb/c 小 鼠 。 免 疫的 方 法 取 决 于 所 用 抗 原 的 性 质 。 免 疫 方 法 同 一 般 血 清 的 制 备 ， 也 可 采 用
27、 脾 内 直 接 免 疫 法 。2） 骨 髓 瘤 细 胞 的 培 养 与 筛 选 ： 在 融 合 前 ， 骨 髓 瘤 细 胞 应 经 过 含 8-AG 的 培 养 基 筛选 ， 防 止 细 胞 发 生 突 变 恢 复 HGPRT 的 活 性 （ 恢 复 HGPRT 的 活 性 的 细 胞 不 能 在 含 8-AG 的 培养 基 中 存 活 ） 。 骨 髓 瘤 细 胞 用 10%小 牛 血 清 的 培 养 液 在 细 胞 培 养 瓶 中 培 养 ， 融 合 前 24h换 液 一 次 ， 使 骨 髓 瘤 细 胞 处 于 对 数 生 长 期 。3） 细 胞 融 合 的 关 键 ：1、 技 术 上 的
28、 误 差 常 常 导 致 融 合 的 失 败 。 例 如 ， 供 者 淋 巴 细 胞 没 有 查 到免 疫 应 答 。 这 必 然 要 失 败 的 。 2、 融 合 试 验 最 大 的 失 败 原 因 是 污 染 ， 融 合 成 功 的 关 键 是 提 供 一 个 干 净的 环 境 ， 以 及 适 宜 的 无 菌 操 作 技 术 。4） 阳 性 克 隆 的 筛 选 ： 应 尽 早 进 行 。 通 常 在 融 合 后 10 天 作 第 一 次 检 测 ， 过 早 容 易出 现 假 阳 性 。 检 测 方 法 应 灵 敏 、 准 确 、 而 且 简 便 快 速 。 具 体 应 用 的 方 法 应
29、根 据 抗 原 的 性 质 ，以 及 所 需 单 克 隆 抗 体 的 功 能 进 行 选 择 。 常 用 的 方 法 有 RIA 法 、 ELISA 法 和 免 疫 荧 光 法 等 。其 中 ELISA 法 最 简 便 ， RIA 法 最 准 确 。 阳 性 克 隆 的 筛 选 应 进 行 多 次 ， 均 阳 性 时 才 确 定 为 阳性 克 隆 进 行 扩 增 。5） 克 隆 化 ： 克 隆 化 的 目 的 是 为 了 获 得 单 一 细 胞 系 的 群 体 。 克 隆 化 应 尽 早 进 行 并反 复 筛 选 。 这 是 因 为 初 期 的 杂 交 瘤 细 胞 是 不 稳 定 的 ， 有
30、丢 失 染 色 体 的 倾 向 。 反 复 克 隆 化 后可 获 得 稳 定 的 杂 交 瘤 细 胞 株 。 克 隆 化 的 方 法 很 多 ， 而 最 常 用 的 是 有 限 稀 释 法 。 显 微 操 作 法 ： 在 显 微 镜 下 取 单 细 胞 ， 然 后 进 行 单 细 胞 培 养 。 这 种 方 法 操作 复 杂 ， 效 率 低 ， 故 不 常 用 。 有 限 稀 释 法 ： 将 对 数 生 长 期 的 杂 交 瘤 细 胞 用 培 养 液 作 一 定 的 稀 释 后 ， 按每 孔 1 个 细 胞 接 种 在 培 养 皿 中 ， 细 胞 增 值 后 成 为 单 克 隆 细 胞 系 。
31、 第 一 次 克 隆 化 时 加 一 定 量的 饲 养 细 胞 。 由 于 第 一 次 克 隆 化 生 长 的 细 胞 不 能 保 证 单 克 隆 化 ， 所 以 为 获 得 稳 定 的 单 克 隆细 胞 株 需 经 2 3 次 的 再 克 隆 才 成 。 应 该 注 意 的 是 ， 每 次 克 隆 化 过 程 中 所 有 有 意 义 的 细 胞都 应 冷 冻 保 存 ， 以 便 重 复 检 查 ， 避 免 丢 失 有 意 义 的 细 胞 。 软 琼 脂 法 ： 将 杂 交 瘤 细 胞 稀 释 到 一 定 密 度 ， 然 后 与 琼 脂 混 悬 。 在 琼 脂 中的 细 胞 不 能 自 由 移
32、 动 ， 彼 此 互 不 相 混 ， 从 而 达 到 单 细 胞 培 养 的 目 的 。 但 此 法 不 如 有 限 稀 释法 好 。 荧 光 激 光 细 胞 分 类 法 ： 用 抗 原 包 被 的 荧 光 乳 胶 微 球 标 记 杂 交 瘤 细 胞 ， 然后 根 据 抗 原 与 杂 交 瘤 细 胞 结 合 的 特 异 性 选 出 细 胞 ， 并 进 行 单 细 胞 培 养 。6） 细 胞 的 冻 存 与 复 苏7） 大 规 模 单 克 隆 抗 体 的 制 备 ： 选 出 的 阳 性 细 胞 株 应 及 早 进 行 抗 体 制 备 ， 因 为 融合 细 胞 随 培 养 时 间 延 长 ， 发
33、生 污 染 、 染 包 体 丢 失 和 细 胞 死 亡 的 机 率 增 加 。 抗 体 制 备 有 两 种方 法 。 一 是 增 量 培 养 法 ， 即 将 杂 交 瘤 细 胞 在 体 外 培 养 ， 在 培 养 液 中 分 离 单 克 隆 抗 体 。 该 法需 用 特 殊 的 仪 器 设 备 ， 一 般 应 用 无 血 清 培 养 基 ， 以 利 于 单 克 隆 抗 体 的 浓 缩 和 纯 化 。 最 普 遍采 用 的 是 小 鼠 腹 腔 接 种 法 。 选 用 BALB/c 小 鼠 或 其 亲 代 小 鼠 ， 先 用 降 植 烷 或 液 体 石 蜡 行 小鼠 腹 腔 注 射 ， 一 周 后
34、 将 杂 交 瘤 细 胞 接 种 到 小 鼠 腹 腔 中 去 。 通 常 在 接 种 一 周 后 即 有 明 显 的 腹水 产 生 ， 每 只 小 鼠 可 收 集 5 10ml 的 腹 水 ， 有 时 甚 至 超 过 40ml。 该 法 制 备 的 腹 水 抗 体 含量 高 ， 每 毫 升 可 达 数 毫 克 甚 至 数 十 毫 克 水 平 。 此 外 ， 腹 水 中 的 杂 蛋 白 也 较 少 ， 便 于 抗 体 的纯 化 。意 义 ：用 于 以 下 各 种 生 命 科 学 实 验 并 具 有 医 用 价 值（ 1） 沉 淀 反 应 ： Precipitation reaction（ 2）
35、凝 集 实 验 ： haemaglutination（ 3） 放 射 免 疫 学 方 法 检 测 免 疫 复 合 物（ 4） 流 式 细 胞 仪 ： 用 于 细 胞 的 分 型 和 细 胞 分 离 。（ 5） ELISA 等 免 疫 学 检 测（ 6） BIAcore biosensor:检 测 Ab-Ag 或 与 蛋 白 的 亲 和 力 。(7) 免 疫 印 记 （ western blotting)（ 8） 免 疫 沉 淀 ：（ 9） 亲 和 层 析 ： 分 离 蛋 白 质（ 10） 磁 珠 分 离 细 胞（ 11） 临 床 疾 病 的 诊 断 和 治 疗 ；23.植 物 细 胞 培 养
36、的 培 养 基 由 哪 些 主 要 成 分 组 成 ？（ 1） 无 机 盐（ 2） 碳 源（ 3） 植 物 生 长 调 节 剂（ 4） 有 机 氮 源（ 5） 维 生 素24.植 物 细 胞 大 规 模 培 养 的 主 要 方 法 及 其 特 点 是 什 么 ？（ 1） 成 批 培 养 法 ： 将 培 养 基 一 次 性 地 加 入 反 应 器 中 ， 接 种 ， 培 养 一 定 时 间 后 收 获 细 胞的 操 作 方 式 。特 点 ： 操 作 强 度 低 ， 设 备 简 单 ， 容 易 发 生 污 染 ， 通 气 受 限 制 。（ 2） 半 连 续 培 养 法 ： 在 反 应 器 中 投
37、料 和 接 种 培 养 一 段 时 间 后 ， 将 部 分 培 养 液 和 新 鲜培 养 液 进 行 交 换 的 培 养 方 法 。（ 3） 连 续 培 养 法 ： 是 利 用 连 续 培 养 反 应 器 ， 在 投 料 和 接 种 培 养 一 段 时 间 后 ， 以 一 定 速度 采 集 细 胞 和 培 养 液 ， 并 以 同 样 速 度 供 给 诶 新 鲜 培 养 基 以 使 细 胞 生 长 环 境 长 期 恒 定 的 方 法 。（ 4） 固 定 化 培 养 法 ： 将 细 胞 固 定 于 尼 龙 网 套 内 ， 或 固 定 于 中 空 纤 维 有 网 状 多 孔 板 ， 尼龙 套 和 中
38、 空 纤 维 膜 上 ， 放 入 培 养 液 中 进 行 培 养 ， 或 连 续 流 入 新 鲜 培 养 液 ， 进 行 连 续 培 养及 连 续 收 集 培 养 产 物 ， 也 可 通 入 净 化 空 气 以 代 替 搅 拌 。25.影 响 植 物 细 胞 积 累 次 级 代 谢 产 物 的 因 素 有 哪 些 ？（ 1） 生 物 条 件 （ 2） 物 理 条 件（ 3） 化 学 条 件（ 4） 工 业 培 养 条 件26.各 种 植 物 细 胞 培 养 的 生 物 反 应 器 的 特 点 是 什 么 ？（ 1） 机 械 搅 拌 式 生 物 反 应 器 ： 有 较 大 的 操 作 范 围 ，
39、 混 合 程 度 高 ， 适 应 性 广 ， 剪 切力 大 ， 容 易 损 伤 细 胞 。（ 2） 鼓 泡 式 生 物 反 应 器 ： 优 于 机 械 搅 拌 式 反 应 器 。 但 由 于 鼓 泡 式 反 应 器 对 氧 的 利用 率 较 低 ， 如 果 用 较 大 通 气 量 ， 则 产 生 的 剪 切 力 会 损 伤 细 胞 。（ 3） 气 升 式 生 物 反 应 器 ： 广 泛 应 用 于 植 物 细 胞 培 养 的 研 究 和 生 产 ， 最 高 细 胞 浓度 和 最 短 倍 增 时 间 可 从 气 升 罐 中 得 到 。（ 4） 转 鼓 式 生 物 反 应 器 ： 生 长 速 率
40、高 ， 其 氧 的 传 递 及 剪 切 力 对 细 胞 的 伤 害 水 平 方面 均 优 于 气 升 式 反 应 器 。（ 5） 固 定 化 细 胞 反 应 器 ： 可 保 护 细 胞 免 受 剪 切 ， 可 长 时 间 重 复 使 用 ， 易 于 实 现 细 胞 的 高 密 度 培 养 ， 细 胞 接 触 良 好 ， 易 于 分 化 ， 有 利 于 次 级 代 谢 产 物 的 合 成 ， 减 少 细 胞 的遗 传 不 稳 定 性 ， 易 于 实 现 连 续 化 操 作 。27.植 物 细 胞 培 养 有 哪 些 新 进 展 ？（ 1） 诱 导 了 在 植 物 细 胞 工 程 研 究 中 的
41、应 用（ 2） 前 体 饲 喂（ 3） 两 相 法 培 养（ 4） 转 基 因 技 术 在 次 级 代 谢 产 物 生 产 中 的 应 用（ 5） 植 物 身 为 转 化 技 术 与 生 物 制 药28.酶 工 程 主 要 研 究 内 容 是 什 么 ？（ 1） 酶 的 分 离 、 纯 化 、 大 批 量 生 产 及 应 用 。（ 2） 酶 和 细 胞 的 固 定 化 及 酶 反 应 器 的 研 究 。（ 3） 酶 生 产 中 基 因 工 程 技 术 的 应 用 及 遗 传 修 饰 酶 研 究 。（ 4） 酶 的 分 子 改 造 与 化 学 修 饰 以 及 酶 的 结 构 与 功 能 之 间
42、关 系 的 研 究 。（ 5） 有 机 相 中 酶 反 应 的 研 究 。（ 6） 酶 的 抑 制 剂 ， 激 活 剂 的 开 发 及 应 用 与 研 究 。（ 7） 抗 体 酶 ， 核 酸 酶 的 研 究 。（ 8） 模 拟 酶 ， 合 成 酶 及 酶 分 子 的 人 工 设 计 、 合 成 的 研 究 。29.固 定 化 酶 回 合 固 定 化 细 胞 的 特 点 和 优 点 各 是 什 么 ？ 怎 样 制 备 ？答 ： 固 定 化 酶 的 特 点 和 优 点 : 同 一 批 固 定 化 酶 能 在 工 艺 流 程 中 重 复 多 次 地 使 用 ； 固 定 化 后 ， 和 反 应 物 分
43、 开 ， 有 利 于 控 制 生 产 过 程 ， 同 时 也 省 去 了 热 处 理使 酶 失 活 的 步 骤 ； 稳 定 性 显 著 提 高 ； 可 长 期 使 用 ， 并 可 预 测 衰 变 的 速 度 ； 提 供 了 研 究 酶 动 力 学 的 良 好 模 型 。 固 定 化 细 胞 的 特 点 和 优 点 ： 使 用 固 定 化 细 胞 省 去 了 酶 的 分 离 过 程 ， 显 著 降 低 了 成 本 。 固 定 化 细 胞 为 多 酶 系 统 ， 不 需 要 辅 助 因 子 增 加 了 细 胞 对 不 利 环 境 的 耐 逆 性 ， 可 重 复 使 用 。 增 加 了 酶 的 稳
44、定 性 。 固 定 化 酶 制 备 ： 吸 附 法 ： 过 载 体 表 面 和 酶 分 子 表 面 间 的 次 级 键 相 互 作 用 而 达 到 固 定 目 的 的 方法 ， 是 固 定 化 中 最 简 单 的 方 法 。 酶 与 载 体 之 间 的 亲 和 力 是 范 德 华 力 、 疏 水 相 互 作 用 、 离 子键 和 氢 键 等 。 包 埋 发 ： 将 酶 包 埋 在 高 聚 物 的 细 微 凝 胶 网 格 中 或 高 分 子 半 透 膜 内 的 固 定 化 方法 。 前 者 又 称 为 凝 胶 包 埋 法 ， 酶 被 包 埋 成 网 格 型 ； 后 者 又 称 为 微 胶 囊 包
45、 埋 法 ， 酶 被 包 埋 成微 胶 囊 型 。 共 价 键 结 合 法 ： 将 酶 与 聚 合 物 载 体 以 共 价 键 结 合 的 固 定 化 方 法 。 交 联 法 ： 使 用 双 功 能 或 多 功 能 试 剂 使 酶 分 子 之 间 相 互 交 联 呈 网 状 结 构 的 固 定化 方 法 。 由 于 酶 蛋 白 的 功 能 团 ， 如 氨 基 、 酚 基 、 巯 基 和 咪 唑 基 ， 参 与 此 反 应 ， 所 以 酶 的 活性 中 心 构 造 可 能 受 到 影 响 ， 而 使 酶 失 活 明 显 。 但 是 尽 可 能 地 降 低 交 联 剂 浓 度 和 缩 短 反 应
46、时间 将 有 利 于 固 定 化 酶 活 力 的 提 高 。 固 定 化 细 胞 的 制 备 ：一 种 固 定 化 细 胞 的 制 备 方 法 ， 包 括 以 下 步 骤 ： 选 用 甲 烷 利 用 细 菌 Methylomonas sp GYJ3， 在 可 供 给 微 生 物 能 量 的甲 烷 和 空 气 的 混 合 气 体 中 ， 辅 以 无 机 培 养 基 进 行 培 养 ； 培 养 好 的 菌 体 细 胞 离 心 后 用 无 机 培 养 基 悬 浮 ， 加 入 到 硅 酸 钠 溶 液 和 盐酸 溶 液 制 成 的 溶 胶 中 ， 待 溶 胶 凝 固 变 成 凝 胶 后 ， 就 制 得
47、了 包 埋 的 细 胞 ，将 包 埋 细 胞 置 于 低 温 环 境 中 以 增 加 包 埋 强 度 ； 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 洗 去 包 埋 细 胞 的 杂 质 ， 充 入 可 给 微 生 物 提 供 能 量 的 相应 的 甲 烷 与 空 气 的 混 合 气 体 ， 在 摇 床 上 培 养 48 120 小 时 。30.为 什 么 要 对 酶 进 行 化 学 修 饰 ？（ 1） .更 好 的 热 稳 定 性 以 及 抗 核 酸 酶 性 对 于 临 床 应 用 很 重 要 ；（ 2） 提 高 酶 蛋 白 在 体 内 的 半 衰 期 ；（ 3） 提 高 酶 蛋 白 的 靶 向 性 ；（ 4
48、） 提 高 酶 蛋 白 效 力 。31.何 谓 分 子 印 迹 ？ 分 子 印 迹 的 应 用 范 围 有 哪 些 ？答 ： 分 子 印 迹 ： 是 指 制 备 对 某 一 特 定 化 合 物 具 有 选 择 性 的 聚 合 物 的 过 程 。 应 用 范 围 ： 用 于 化 学 仿 生 传 感 器 色 谱 分 离 固 相 萃 取 天 然 杭 体 模 拟 模 拟 酶 催 化 控 缓 释 药 物32.有 机 相 酶 反 应 的 定 义 及 其 优 点 是 什 么 ？答 ： 有 机 相 酶 反 应 ： 是 指 酶 在 具 有 有 机 溶 剂 存 在 的 介 质 中 所 进 行 对 的 催 化 反
49、应 。 优 点 是 ： 增 加 疏 水 性 底 物 或 产 物 的 溶 解 度 。 热 力 学 平 衡 向 合 成 方 向 移 动 。 可 抑 制 有 水 剂 中 分 离 纯 化 产 物 。 酶 不 溶 于 有 机 介 质 ， 易 于 回 收 再 利 用 。 容 易 从 低 沸 点 的 溶 剂 中 分 离 纯 化 产 物 。 酶 的 热 稳 定 性 提 高 ， PH 的 适 应 性 扩 大 。 无 微 生 物 污 染 。 能 测 定 某 介 质 中 反 应 时 ， 通 过 改 变 溶 剂 ， 能 够 控 制 底 物 的 特 异 性 、 区 域 选择 性 和 立 体 选 择 性 ， 并 可 以 催 化 某 些 在 水 中 不 能 进 行 的 反 应 。33.何 谓 人 工 模 拟 酶 ？答 ： 人 工 模 拟 酶 ： 是 指 根 据 酶 的 作 用 机 理 ， 用 各 种 方 法 人 为 制 造 的 具 有 酶 性 质 的 催 化剂 。34.发酵工程的研究内容包括哪些？ 发酵工程研
