1、一、名词解释1. 生物技术：也称生物工程（bioengingineering），是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。2.植物组织培养：是指在无菌条件下，把离体的植物器官、组织、细胞、原生质体等材料接种在人工培养基中，使其发育成完整植株的过程。3、植物细胞全能性：任何一个拥有完整细胞核的植物细胞都具有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，在特定条件下表达可产生独立的个体。4.脱分化：也叫去分化，已经停止分化的细胞、组织、器官在离体培养条件下，逐渐失去其原来的结构和功能而恢复其分生
2、状态，形成无组织结构的细胞团的过程。5.再分化：由脱分化产生的无组织结构的细胞团在离体培养条件的剌激下重新分化成具有不同结构和功能的细胞、组织、器官的过程，即再分化。 6.培养基：是植物组织培养的物质基础。其成分是植物生长发育所必需的各种物质的来源，主要包括营养元素、植物生长调节剂、碳源、维生素、有机添加物等。 7.外植体：在植物组织培养中，用来进行培养的植物材料常称外植体(explant)，包括植物器官、组织、细胞等。7.重组 DNA 技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA 体外操
3、作程序，也称为分子克隆技术。8.基因工程：就是将目的基因插入到载体（质粒，病毒）中，再把携带目的基因的载体转入受体材料细胞中，使目的基因在受体细胞中表达。进而使受体生物表现出目的基因的性状。限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链 DNA 中的特定核苷酸序列，并在特定位点切割双链 DNA 的内切酶。平齐末端：当限制酶在它识别序列的中心轴线处将 DNA 的两条链切开时，产生的则是平末端。粘性末端：当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将 DNA 的两条链分别切开时，产生的就是黏性末端。同裂酶：能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割
4、DNA 后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。9.限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1 小时内完全酶解 1g 特定 DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量，为一个活性单位。10.限制性物理图谱：DNA 上某些限制性内切酶酶切位点的图谱，可作为 DNA 片段的特殊标记。也称 DNA 物理图谱。11.限制性内切核酸酶的切割频率：切割频率是指限制性内切核酸酶在 DNA 分子中的预测切点数。12.回文序列：双链 DNA 中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。这段序列被称为回文序列。13.克隆载体: 将外源基因携带入宿主细胞，并在宿主细胞中进行 DNA 扩增和使外源基
5、因得以高效表达。 14.表达载体:在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。15.目的基因:把需要研究的基因称为目的基因（靶基因或者插入基因）。要分离、改造、扩增或表达的基因。1、标记辅助选择（Marker-assisted Selection, MAS）：就是对特定的主效基因（ major gene）或者数量性状位点（Quantitative Trait Loci, QTL）在遗传标记的辅助下区分其基因型，并在此基础上应用于育种实践。2、细胞学标记：即植物细胞染色体的变异。包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（
6、C 带、N 带、G 带等）的变化。3、分子标记：广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的 DNA 序列或蛋白质。狭义的分子标记概念只是指 DNA 标记，而这个界定现在被广泛采纳。4.基因组文库：将目标生物的全部基因组 DNA 切割成一定长度的 DNA 片段并克隆到某种载体上而形成的集合。5.SNP：单核苷酸多态性，在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性。6.动物细胞培养：是指离体细胞在无菌条件下进行分裂生长，但是在整个培养过程中细胞不出现分化，不再形成组织。7.遗传标记：指可追踪的染色体或染色体上的某一段或某个基因在家系中可传递的任何一种遗
7、传特性，是遗传多样性的表示方法。8.动物生物反应器：利用转基因活体动物，高效表达某种外源蛋白的器官或组织，进行工业化生产功能蛋白质的技术。9.共显性：杂合子的一对等位基因都具有各自的表现效应，当这一对等位基因杂合时，有两种表现性共存，便于区别的纯和基因型和杂合基因型。10.cDNA 文库： 是将目标生物某一发育时期或者是某一组织器官的全部 mRNA 反转录成cDNA 并克隆到载体上而形成的集合11.人工种子：是指利用细胞全能性，将植物离体培养产生的体细胞胚或者具有发育成完整植株能力的分生组织包埋在含有营养物质并具有保护能力的外壳内，形成在适宜条件下能发芽出苗的颗粒体。12.胚状体：指植物组织培
8、养过程中，由非合子细胞经胚胎发生发育而形成具有胚状结构，具有发育成完整植株能力。二，填空1.克隆载体即携带目的基因进入宿主细胞进行复制或保存的载体，包括质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、工染色体载体2.所有切割双链 DNA 分子中相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，从而使核酸分子发生水解断裂的酶，即核酸酶。根据其水解方式不同分为外切核酸酶和内切核酸酶，根据其底物不同又可分为 RNA 酶和 DNA 酶3.细菌细胞中的限制行内切酶识别位点被甲基化酶保护起来了，限制行内切酶对已经甲基化的识别位点无效，从而使自身的 DNA 不被切割。因此，限制行内切酶和能识别相同位点的甲基化酶一起构成了限制-修饰系统4.
9、型限制性内切酶切割双链 DNA 分子后产生的末端片段，有黏末端和平末端5.Ti 质粒都含有一下四个区：T-DNA 区，Vir 区，Con 区，Ori 区。6.培养基的成分： 1.大量元素 2.微量元素 3.有机成分 4.植物生长调节剂 5.培养基其他成分6.PH 值 7.母液：指培养基的浓缩液，也称储备液，一般将培养基原来配方扩大 10 倍，20倍，100 倍甚至更高倍数，配置母液和培养基一般用纯度较高的蒸馏水。简答题1.AFLP 标记技术原理：由于不同物种的基因组大小不同，基因组 DNA 经限制性内切酶酶切后产生的限制性片段的分子量大小不同。使用特定的双链接头与酶切 DNA 片段连接作为扩增
10、反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板 DNA 进行扩增，选择性碱基的种类,数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，所以只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，根据凝胶上 DNA 指纹的有无来检出多态性。2.Northern 杂交原理 ：外源基因如果正常表达，在转化植株的细胞有其转录产物- 特异mRNA 生成，提取总 RNA 或 mRNA 并进行凝胶电泳，转膜并与标记好的探针杂交形成DNA-RNA 杂合体，通过探针上的标记可检测出目的 mRNA。Northern 杂交程序：探针制备 探针选择：检测外源基因转录
11、的 mRNA 应使用同源的 DNA 探针，杂交后形成 DNA-RNA 杂合体；也可使用 cDNA 探针。探针序列的获得人工合成 PCR 方法 质粒酶切法 探针标记切口平移法转化植株总 RNA 的提取。RNA 纯度的分析：A260/A280=1.72.0,2.0 若2 表明有异硫氰酸污染，有异丙醇重新沉淀，RNA 浓度计算:RNA(ug/ml)=A260稀释倍数40ug/ml 分离柱层析法电泳- 甲醛变性电泳 单链使 RNA，其链内碱基易于氢键形成二级或三级结构，而甲醛与碱基结合后形成保持线性，电泳时才与分子量标记成正比。转膜- 烘膜-杂交- 信号检测-分析结。3.wetern 杂交原理：若目的
12、基因表达正常，则在转基因植物中含有一定量的目的蛋白。从转基因植物中提取总蛋白质，两蛋白质样品溶于去污剂和还原剂的溶液中，经 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子发小分离，将分离的各蛋白条带原位转印到固相膜上。膜在高浓度的蛋白质中温育，以封闭非特异位点，加入特异抗体，印记上的目的的蛋白与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的标记好的二抗，最后痛过二抗上的标记化合物的性质进行检出。4.可被利用的遗传标记应具备以下几个条件：多态性高；表现为共显性；对农艺性状影响小；经济方便，容易观察记载。5.基因组文库： 是将目标生物的全部基因组 DNA 切割成一定长度的 DNA 片段并克隆到某种载体上而形成的集
13、合。根据所用载体不同，基因组文库分为以下几种。质粒文库，噬菌体文库，黏粒文库，人工染色体文库。6.基因组文库的构建步骤：1 目标植物基因组 DNA 提取及片段化 2 载体的选择与制备 3 DNA 片段与载体连接，噬菌体进行离体包装 4 重组体感染宿主细胞（大肠杆菌）5 转化细胞的筛选放射性标记探针进行文库杂交筛选7.mRNA 差异显示技术分离差异表达的基因：其基本原型： 利用真核生物成熟 mRNA 的3“polyA 结构，用 oligo(dT)12MN（其中 M 为锚定碱基，起增大引物 Tm 值得作用，M为 A,C,G,T 中的任意一种）作为描定引物与 mRNA 的 PLOYA 结合，再反转录
14、酶的作用下将 MRNA 反转录成 mRNA-cDNA 的杂交分子，这一过程即差异显示反转录，然后在用10BP 的随机引物与 OLIHO(DT)12MN 组成的引物对，以 MRNA-CDNA 为模板进行 PCR扩增，PCR 产物进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，通过放射自显影或显色反应即可获得差异表达基因的扩增条带。聚合酶链式反应：在有 DNA 单链，引物，DNTPS、DNA 聚合酶等条件下，DNA 聚合酶即可从引物开始沿单链 DNA 的 5”3“合成其互补链，而 PCR 仪可以使这一反应不断进行下去，直到条件不复存在。8.PCR 反应原理 ：RT-PCR 即反转录 PCR，以 MRNA 为模板，在反转录
15、酶的作用下，合成 CDNA 第一链的过程。在已知目的基因 CDNA 序列的情况下可用此法来分离目的基因。二高温高压灭菌注意事项 ： 1.灭菌锅提前加入适量的水 2.锅内待灭菌的培养基应放平不倾倒 3.锅内不要装太满 4,。锅内冷气要排放出去 5.灭菌条件严格控制 6.灭菌完成后，应排气降压，待压力表指回 0 才能打开锅盖三外植体的选择原则： 1 再生能力强 2.遗传稳定性好 3.来源丰富 4.灭菌容易 5.外植体的大小一培养基的类型 1.含盐类较高的培养基：MS 培养基 2.硝酸钾含量较高的培养基 ：B5 N6 SH 培养基 3.无机盐中等含量的培养基：包含 H 培养基等，适合花药培养 4.无
16、机盐含量较低的培养基：主要 WS 培养基等，适合生根培养二培养基的配置及注意事项 1.准备好称量的器具，按培养基的配方及所要配置的数量计算好各成分的分量，取出母液并按顺序排好 2.在可加热容器内加所配培养基数量三分之一的蒸馏水，按量加入琼脂，按计算好的母液分别加入大量元素，微量元素，铁盐，有机物，其他物质，最后加入适量蔗糖搅拌均匀，生长调节剂必须在高温高压灭菌后再加入 3.加蒸馏水定容，搅拌均匀并做好标记 4.调节 PH 值，常用 5.8。5.分装，注意不要让培养基沾到内壁瓶口，做好标记 6.封口，培养基分装好后，一般用硫酸纸，耐高温塑料盖，封口膜封口，防止污染。1.人工种子的结构人工种子由胚
17、状体、人工胚乳和人工种皮三部分组成。胚状体:包括组培过程中产生的愈伤组织、顶芽、腋芽、不定芽、原球茎和小鳞茎等繁殖体人工胚乳:一般由供应胚状体养分的胶囊组成其养分主要有矿质元素、维生素、碳源、激素等，有时还添加杀虫剂、杀菌剂、除草剂和一些有益微生物人工种皮:即胶囊之外的薄膜，是人工种子的最外层部分。要求具有机械保护作用，同时又能通气，但是又不能使水分和养分外流。2.基因的时空表达是细胞分化和个体发育的根本原因?基因:染色体上具有特定结构和功能的 DNA 片段。不同基因表达不同的蛋白质，所以不同生物体表现出不同的性状。即基因决定生物体的性状，基因一般都包含 5非转录区、起始密码子、转录区、终止密
18、码子、3非转录区。3.基因的性质:1:不同的基因具有相同的物质基础2:基因是可以切割的3:基因是可以转移的4:基因和多肽之间是对应的5:遗传密码是通用的6:基因可以通过复制把遗传信息传递给后代 6:基因可以通过复制把遗传信息传递给后代 。八、分子标记技术4、分子标记特点: 直接以 DNA 形式表现，在生物体各发育阶段,各组织均可检测到。与生长发育无关，取材不受限制；数量多，信息量大,遍及整个基因组;多态性高，自然界存在许多等位突变，无需专门创造特殊的遗传材料;中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁;许多分子标记表现为共显性（codominance）, 能够鉴别出纯合基因型与杂 合基因
19、型，提供完整的遗传信息;真核生物中，基因组 DNA 多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的 DNA 序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约.5、SSR 标记的定义及其主要特点定义：也称微卫星或短串联重复序列多态性（STRP ）。是利用真核生物基因组中存在的大量简单串联重复序列。特点： 数量丰富，广泛分布于整个基因组；人和动物（TG）n， 植物（AT）n微卫星 DNA 两端多是高度保守的单拷贝序列 ,微卫星 DNA 长度的多态性,具有较多的等位性变异；共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；1. 实现细胞全能性的两个条件是什么？必须把细胞从植物体的相应部位分离出
20、来。必须给予它们适当的刺激，尤其是激素的作用。2. 配制母液的好处是什么？使用母液可以保证培养基各成分的准确性，配制及使用的方便性，从而显著提高工作效率。3. 试管苗为什么不能直接移植于大田？由于试管苗的生长环境不同于自然外界环境，因此其具有高湿、弱光、恒温、低透气性等特点。所以需要驯化后才能移栽。二、基因工程原理：3、重组 DNA 技术的三大基本元件：供体、受体、载体。4、基因工程基本用途（意义）分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源；大规模生产生物活性物质（基因调节）；设计、构建生物的新性状甚至新物种（正义、反义）5，与形态学标记，细胞学标记生化标记相比，分子标记具有哪些明显的优越性？1
21、 直接以 DNA 形势表现，在生物体的各个组织，各各个发育阶段均可检测到，不受季节，环境限制，不存在表达与等问题。2 数量基多，遍布整个基因组，可检测的座位几乎是无限的。3 多态性高，自然界存在许多等位变异，无需人为创造。4 表现为中性，不影响目的性状的表达 5 许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体、5、基因克隆中三个基本要点是：基因克隆就是 PCR 技术，三个基本要点是： 变性（将 DNA 加热到 90-95 度）。复性（将 DNA 降温至 55-60 度）。 延伸（将 DNA 升温到 70-75 度）。基因工程的基本程序包括：获得目的基因重组质粒构建基因工程菌工程菌大规模培养分
22、离提取目的产物。6.作为基因工程载体，必须满足哪些条件？1 可转移性，即能携带目的基因进入宿主细胞。2 可自主复制，能在宿主细胞中实现目的基因的增值。3 多克隆位点，由单一的限制性内切酶识别位点组成 4 合适的选择标记。用于重组质粒的宿主细胞筛选。7、基因工程操作的基本步骤是什么？获得目的基因（DNA 片段）； 目的基因克隆（复制）与验证；表达载体构建：将目的基因与载体组合成能在目的生物中表达的形式（重组 DNA）；转化：把重组 DNA引入某种受体生物或细胞；筛选：从大量的受体中筛选出可能具有目的基因且目的基因能够表达的个体或细胞。一、生物技术与农业：（1）、植物基因工程育种：培育抗病虫作物、
23、抗逆育种、抗除草剂育种、品质种改良（2）植物细胞工程 1、植物次级代谢细胞：利用植物细胞培养生产的植物次生代谢产物包括药用成分、香料、色素、杀菌剂等，已经成功培养出紫草宁、人参皂苷、紫杉醇、阿马里新等一系列的天然植物次生代谢物质，植物次生代谢产品的市场潜能 2、快速无性繁殖 3、原生质体融合 4、花粉、花药和胚的培养 5、遗传转化中的应用6、物质资源保存（3）生物医药 1、我国首次利用除虫菊成功开发出无公害农药，2、苏云金芽孢杆菌是应用最广的杀虫细菌 3、白僵菌是防止鳞翅目昆虫的真菌制剂 4、昆虫病毒5、生物肥料（4）动物基因工程育种：动物分子育种技术主要包括基因工程技术、细胞工程技术、胚胎工
24、程技术等（5）动物繁殖新技术：1、人工授精及精液的冷冻保存 2、胚胎移植及胚胎的冷冻保存 3、体外胚胎生产 4、胚胎分割技术性别控制技术 5、性别控制技术（6）1、DNA 重组生长激素的作用 2、利用微生物发酵技术生产饲料添加剂 3、寡糖、寡肽类饲料添加剂或称益生素（7）动物生物反应器：利用转基因活体动物，高效表达某种外源蛋白的器官或组织，进行工业化生产功能蛋白质的技术。主要是乳腺生物反应器 未来石油的替代物乙醇 优点：产能效率高、燃烧不产生 CO 等有害物质污染小、可通过微生物发酵大量生产成本低。乙醇只要是由酵母菌以蔗糖和淀粉为原料进行发酵产生的。二、生物技术与安全：1、对人和动物的潜在危害
25、：致病性、抗药性、食品安全性 2、对生态环境的潜在危害：致病性和毒性、生存竞争力、传播扩散能力、遗传变异能力、遗传转移能力 3、转基因作物 4、生物武器：目前世界上公认的对人类危害最大的最易散发的三种生物武器是：炭疽杆菌、天花病毒、肉毒杆菌。三、工具酶：限制性核酸内切酶2、粘性末端的意义？连接方便：不同的 DNA 双链：只要粘性末端碱基互补可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。同一个 DNA 分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 2.影响限制性酶活性的因素有哪些？在酶切反应中，DNA 的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时
26、间等措施以达到完全酶切。但应该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切(星号活性) 。当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施? 为什么?注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。6、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。用属名的第一个字母和种名的头两个字母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌（Escherichia coli）用 Eco 表示。用一个大写字母表示菌株或型。如 EcoR。同一宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马字母表示。如 EcoR I8、什么是限
27、制性内切核酸酶的星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和切割效率的改变？受哪些因素的影响? DNA 的纯度。 DNA 的甲基化程度。 温度 Tm。缓冲液 Buffer。10、计算下列两种酶各自在某染色体 DNA 序列上识别位点间的平均距离：Alu I：5 AGCT 3， EcoR I: 5GAATTC 3四、工具酶：连接酶与聚合酶1、DNA 连接酶的定义：把两种来源的 DNA（用同一种限制酶切割）的黏性末端粘合起来。2、DNA 连接酶连接反应的条件：必须是两条双链 DNA。DNA3 端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。 需要能量。3、影响 DNA 连接酶连接反应的因素主要有哪些？插
28、入片段与载体的浓度比例。 1020 倍。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。反应温度：12.5。一般 1416。4、DNA 连接酶的连接机理是什么？ATP（NAD+)提供激活的 AMP 一磷酸腺苷 。ATP 与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸 PPi。AMP 与连接酶的赖氨酸 -氨基相连。AMP 随后从连接酶的赖氨酸 -氨基转移到 DNA 一条链的 5端 P 上，形成“DNA- 腺苷酸”复合物。3-OH 对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出 AMP。5、DNA 连接酶的作用特点有哪些？6、DNA 聚合酶的特点：DNA 聚合酶的特点为需要 DNA 模
29、板、需要 RNA 或 DNA 做为引物、催化 dNTP 加到引物的 3末端。DNA 聚合酶以四种三磷酸脱氧核苷为原料，这种酶的共同性质是：需要 DNA 模板，因此这类酶又称为依赖 DNA 的 DNA 聚合酶（DNa dependent DNA polymerase， DDDP）。需要 RNA 或 DNA 做为引物（ primer），即 DNA 聚合酶不能从头催化 DNA 的起始。催化 dNTP 加到引物的 3末端，因而 DNA 合成的方向是 53。三种 DNA 聚合酶都属于多功能酶，它们在 DNA 复制和修复过程的不同阶段发挥作用。7、DNA 聚合酶与 DNA 连接酶的异同点？相同点：催化两个
30、脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键。不同点：连接酶不需要模板，聚合酶需要的一条链为模板；连接酶的作用对象是游离的 DNA 片段，聚合酶的作用对象是单个的脱氧核苷酸； 连接酶的作用结果是形成完整的 DNA 分子，聚合酶的作用结果是形成 DNA 的一条链；连接酶用于基因工程，聚合酶用于 DNA 复制。五、载体与质粒：3、克隆载体必须具备什么条件? 具有使外源 DNA 片段插入的限制性酶识别位点（外源性 DNA 能组入）.能将外源DNA 导入到受体细胞并进行自我复制（能繁殖）。必须具有选择标记（能筛选出来）。4、基因工程中有三种主要类型的载体：质粒型载体、病毒型载体、混合型载体5、pUC 质粒利用 -互补
31、作用筛选重组子原理是什么？（蓝白斑实验） 基因载体上含有-半乳糖苷酶（LacZ)的基因，当外源 DNA 插入到载体的 LacZ 基因上后将造成 -半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的 X-gal(5-溴-4- 氯-3-吲哚-D- 半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有 X-gal-IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）培养基的颜色变化直接观察出来。5、举例说明什么是穿梭载体？ 是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在 E.coli 中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。6、表达载体必须具备的条
32、件？载体能够独立的复制；应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选；应具有很强的启动子，能被 RNA 聚合酶所识别；应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；应具有很强的终止子，以使 RNA 聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，同时使很强的终止子所产生的 mRNA 较为稳定；6、所产生的 mRNA 必须具有翻译的起始信号，以便转录后能顺利翻译。2、未知基因的获得途径？构建基因组文库利用鸟枪法克隆目的基因。 构建 cDNA 文库，筛选目的基因。mRNA 差异显示技术筛选差异表达基因。 酵母双杂交体内鉴定基因。3、利用用限制性内切酶把基因组 DNA 切成不
33、同大小的片断的优点和缺点？优点：如果带有粘性末端，产物可以直接与载体连接，连接效率高。缺点： 目的基因内部可能有内切酶的切点， 目的基因也被切成碎片。消化的片断分子量太大或太小，不符合载体容量，不能克隆。4、基因组文库定义？什么是 cDNA 文库？同基因组文库有何差别?基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。cDNA 文库：某种生物基因组转录的的全部 mRNA 经反转录产生的各种 cDNA 分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为 cDNA 文库。区别：克隆均一性：cDNA 文库大小不一，基因组文库大
34、小基本一致。基因覆盖率：cDNA 文库包含部分基因，基因组文库包含所有基因。5、构建基因组文库时连接方法主要是粘性末端连接法；而构建 cDNA 文库，可用接尾连接法或人工接头连接法。6、构建 cDNA 文库的一般步骤？细胞总 DNA 的提取和 mRNA 的分离。 第一链 cDNA 合成。第二链 cDNA 合成。双链 cDNA 的分级分离。 双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。重组体的筛选与鉴定。分离基因文库中目的基因的方法有：核酸杂交法、差别杂交筛选、mRNA 差别显示法、酵母双杂交筛选法 （建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆？）用目的基因制作一个引物，进
35、行 pcr 扩增就知道究竟克隆载体是否带有目的 基因片段了。七、转基因育种1、作物转基因育种定义及其优势：优势： 拓宽可利用的基因资源；培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径；可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择；可以大大提高选择效率，加快育种进程。此外，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品2、定义:就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经 DNA 重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。3、植物遗传转化的表达载体有哪两大类？质粒载体系统；病毒载体系统。4、一元载体系统；双元载体系统
36、定义；二者的不同一元载体系统（整合载体系统）：这一类载体系统由外源基因表达结构和改造后的卸甲(去掉致瘤基因，disarmed)Ti 质粒组成。在农杆菌内，通过同源重组将外源基因整合到修饰过的 T-DNA 上，形成可穿梭的共整合载体，在 Vir 基因产物的作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。但这类方法构建困难，整合体形成率低 。双元载体系统：它由两个分别含有 T-DNA 和 Vir 区的相容性突变 Ti 质粒即：微型 Ti 质粒（mini-Ti plasmid ，相当于 T-DNA ）、辅助 Ti 质粒（helper Ti plasmid ，相当于 vir 区）。T-DNA 和 Vir 基
37、因在两个独立的质粒上，通过反式激活 T-DNA 转移到植物细胞基因组内。微型 Ti 质粒就是含有 T-DNA 边界但缺失 Vir 基因的 Ti 质粒，为一个广谱质粒。它含有一个广泛寄主范围质粒的复制起始位点（OriV），同时具有选择性标记基因。辅助质粒为含有 Vir 区段但 T-DNA 缺失的突变型质粒。因此相当于共整合载体系统中的卸甲质粒。其作用是提供 Vir 基因功能，激活处于反式位置上的 T-DNA 转移。 与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。5、农杆菌转化法的步骤及其优点。步骤： 植物受伤 : 植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙
38、酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导 Ti 质粒上的毒性基因表达。感染植物 :农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。毒性基因（vir）表达:virA、virG 、virD、virB 。T-DNA 转移:T-DNA 被 vir 基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。诱导冠瘿瘤: T-DNA 上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。土壤农杆菌代谢冠瘿碱。优点: 多为单拷贝或寡拷贝整合，转基因遗传较稳定，减少了共抑制等基因沉默现象属于单细胞转化，不存在嵌合体现象； 成本较低，转化效率较高。具有高多态性和易于检测等优点，实验重复性好，结果可靠；由于创建新的标
39、记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。6、AFLP 技术基本原理：基因组 DNA 经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段将特定双链接头连接在这些 DNA 片段的两端，形成一个带接头的特异片段，作为 DNA扩增的模板根据接头的序列和酶切位点设计引物，即接头+ 酶切位点+2-3 个核苷酸，然后进行特异性 PCR 扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可产生数量丰富的带型标记，分辨率高，是一种十分理想和高效的遗传标记。接头序列以及与其相连的限制位点作为随后进行的限制片段扩增的引物结合位点PCR 引物 3末端含有选择核苷酸，选择核苷酸延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择核苷酸配对的限制性酶切片段被扩增扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。
