1、蛋白浓度测定蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA 法，胶体金法染色性质：考
2、马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA 法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。常用的测定蛋
3、白质含量方法的比较方 法 测定范围（g/ml） 不同种类蛋 白的差异 最大吸收波 长(nm) 特 点凯氏定氮法 小 标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光度法 1001000 大 280205 灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响双缩脲法 100010000 小 540 重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大Folin-酚试剂法 20500 大 750 灵敏，费时较长，干扰物质多考马氏亮蓝 G-250 50500 大 595 灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移BCA 50500 大 562 灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长由于凯氏定氮法的
4、操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍 Folin酚试剂法，考马氏亮蓝 G250 染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。试验一：BCA 法BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂 SDS，Triton X-100，Tween 不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA ，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。基本原理：碱性条件下，蛋白将 Cu2+还原为 Cu+， Cu+与 BCA 试剂形成紫颜色的络合物，测定其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。主要特点1. 准确灵敏,
5、 线性范围广： BCA 试剂的蛋白质测定范围是 102000ug/ml；2. 快速：45 分钟内完成测定，比经典的 Lowry 法快 4 倍而且更加方便。3. 经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。4. 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。5. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。试剂要求BCA 试剂 A, B 液室温保存，蛋白标准 (5mg/ml) -20保存仪器准备96 孔板，酶标仪，37 恒温箱使用说明1. 配制工作液: 根据标准品和样品数量，按体积比 A ：B （50：1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀。BCA 工作液室温 24 小时内稳定。2. 稀释
6、标准品：取 10 微升标准品用 PBS 稀释至 100ul（标准品一般可用 PBS 稀释） ，使终浓度为 0.5mg/ml。将标准品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20ul 加到 96 孔板的蛋白标准品孔中，加 PBS 补足到 20ul。或者依照下面的表格中设置的浓度做标准曲线。3. 加适当体积样品到 96 孔板的样品孔中，补加 PBS 到 20ul。一般蛋白样品可以几个不同的稀释比例检测，常用的是每孔中加入 1ul，2ul，4ul 样品，补加 PBS 到 20ul。4. 各孔加入 200ul BCA 工作液，37放置 30 分钟。5. 冷却到室温，用酶标仪 562nm 测定
7、 OD 值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。20ul 体系蛋白浓度 mg/ml 加入 C 液量 ul 补足 PBS 量ul0 0 200.05 0.2 19.80.1 0.4 19.60.2 0.8 19.20.3 1.2 18.80.4 1.6 18.40.5 2 180.6 2.4 17.60.7 2.8 17.20.8 3.2 16.80.9 3.6 16.41 4 161.5 6 142 8 122.5 10 103 12 83.5 14 64 16 45 20 0注意事项1. 在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或 37温育使溶解, 如发现细菌污染则应丢弃。2. 样品中若含有 EDTA
8、、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用 TCA 沉淀去除干扰物质。3要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔, 每次均应做标准曲线。4当试剂 A 和 B 混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失，工作液在密闭情况下可保存 1周。5需准备 37水浴或温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为 540-595nm 之间，562nm 最佳。酶标仪需与 96 孔酶标板配套使用。使用分光光度计测定蛋白浓度时，试剂盒测定的样品数量会因此而减 少。使用温箱孵育时，应注意防止因水粉蒸发影响检测结果。二、考马氏
9、亮蓝 G250 染色法（Bradford 法）此方法是 1976 年 Bradform 建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。【原 理】考马氏亮蓝 G250 具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从 465nm 转移到 595nm 处，在一定的范围内，蛋白质含量与 595nm 的吸光度成正比，测定 595nm 处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。【操作步骤】1、标准曲线的制备：按下表操作，在试管中分别加入 0、20、40、80、100 微克
10、蛋白标准溶液，用水补足到 100 微升，加入 3ml 的染色液，混匀后室温放置 15 分钟。编 号 1 2 3 4 5 6蛋白标准(ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10蒸馏水(ml) 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0染色液(ml) 3 3 3 3 3 3在 595nm 波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。2、血清蛋白质测定稀释血清（或其它蛋白样品溶液），准确吸取 0.1ml 血清，置入 50ml 容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（此为稀释 500 倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以 1、2
11、、3 号，按下表操作。混匀后室温放置 15 分钟，在 595nm 波长比色，计算蛋白质浓度。试剂(毫升) 1(空白管) 2(标准管) 3(样品管)蒸 馏 水 0.1 蛋白质标准 0.1 稀释血清 0.1染 色 液 3 3 3【计 算】每 100 毫升血清中蛋白质的含量（g）【试 剂】1、考马氏亮蓝 G250 染色液：称取 100mg 考马氏亮蓝 G250 溶解于 50 毫升 95的乙醇中，加入 100 毫升 85的磷酸，加入稀释到 1 升。2、蛋白标准（0.1mg/ml）准确称取 10mg 牛血清白蛋白，在 100ml 容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装，20冰箱保存。【注意事项】1、常用试剂
12、的干扰：有些常用试剂在测定中会受到不同程度的干扰。Tris、巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA 及少量去垢剂有较少影响，而 1SDS、1 TritonX-100 及 1Hemosol 的干扰严重。2、显色结果受时间与温度影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行。3、考马氏亮蓝 G250 染色能力很强，特别要注意比色杯的清洗。颜色的吸附对本次测定影响很大。可将测量杯在 0.1mol/L HCl 中浸泡数小时，再冲洗干净即可。三、紫外分光光度法紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是将蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作很简便，而且样品可以回收。【原 理】蛋白质溶液在
13、 280nm 附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在 260nm。所以同时测定 280 及 260nm 两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。【操 作】将待测蛋白质溶液适当稀释 K 倍，在紫外分光度计中分别测定样品在 10mm 光径石英比色皿中，分别在 280nm 及 260nm 两种波长下的吸光度值 A280 和 A260。【计 算】1、当蛋白样品的吸光收比值 A280A260 约为 1.8，可用下面的公试进行计算：蛋白质浓度（mg/ml）（1.45A
14、 280 0.74A 260）K（稀释倍数）2、也可以先计算出 A280A260 的比值后从下表中查出校正因子 “F”值，由下面的经验公式计算出溶液的蛋白质浓度。同时从表中还可以查出样品中混杂的核酸的百分含量：蛋白质浓度（mg/ml）FA280 KA280/A260 核酸(%) F A280/A260 核酸(%) F1.75 0.00 1.116 0.846 5.50 0.6561.63 0.25 1.081 0.822 6.00 0.6321.52 0.50 1.054 0.804 6.50 0.6071.40 0.75 1.023 0.784 7.00 0.5851.36 1.00 0.9
15、94 0.767 7.50 0.5651.30 1.25 0.975 0.753 8.00 0.5451.25 1.50 0.944 0.730 9.00 0.5081.16 2.00 0.899 0.705 10.00 0.4781.09 2.50 0.852 0.671 12.00 0.4221.03 3.00 0.814 0.644 14.00 0.3770.979 3.50 0.776 0.615 17.00 0.3220.939 4.00 0.743 0.595 20.00 0.2780.874 5.00 0.682 注：一般纯净蛋白质的光吸收比值 A280/A260 约为 1.8，
16、而核酸 A280/A260 的比值约为 0.5。【方法评价】操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。但核酸含量小于 20或溶液混浊、则测定结果误差较大。在使用上表和公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在 280nm及 260nm 处的光吸收值也不尽相同，故计算结果有一定误差。四、双缩脲法【原 理】利用半饱和硫酸铵或 27.8硫酸钠亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质酶、蛋白激素等的分离和纯化。蛋白质和双
17、缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有 CH2NH2 等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。本实验用 27.8硫酸钠亚硫酸钠溶液稀释血清，取出一部分用双缩脲反应测定蛋白质的含量，剩余部分则用滤纸过滤，使析出的球蛋白与白蛋白分离，取出滤液用同一反应测定白蛋白的含量。总蛋白与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白与球蛋白之比即所谓的白球比值。【操 作】1、取中试管 4 支，分别标以“1”、“2”、“3”、“4”，吸取 27.8硫酸钠亚硫
18、酸钠1ml，置“1”管中备用。2、吸取血清 0.2ml 于另一试管中，加 27.8硫酸钠一亚硫酸钠 4.8ml，用拇指压住管口倒转混合 56 次，放置约 15 秒，用 1ml 刻度管吸取 1ml 置于管 “4”中（总蛋白测定管）。3、将剩余的血清混悬液（如滤液不清，可重复过滤，直至澄清为止），用另一支 1ml 刻度吸管取此液 1ml，置于管 “3”（白蛋白测定管）。4、另用一支 1ml 刻度吸管吸取标准血清 1ml，置管“2”中（标准管）。5、于上述 4 支试管中分别加入双缩脲试剂 4ml，混匀。6、在室温下放置 10 分钟后，以管“1”（空白管）调零，在 540nm 的波长下进行比色，分别记
19、录“2”、“3”、“4”管的光密读数【计 算】血清球蛋白含量（克100ml）总蛋白含量白蛋白含量白：球比值白蛋白含量球蛋白含量。【临床意义】正常人每 100ml 血清中含蛋白质 68 克，平均 7 克左右，白球比为 1.52.5:1。长期营养不良，肝脏疾病，慢性肾炎时，总蛋白含量降低；大量失水（如呕吐、腹泻）时则升高。肝脏疾病、慢性肾炎以及慢性传染病有大量抗体生成时，白球比值变小，甚至倒置。【试剂与器材】（一）器材1、中试管 6 支。2、刻度吸管：0.2ml、5ml、10ml、1ml。3、玻璃漏斗。4、快速滤纸。5、分光光度计。（二）试剂1、27.8硫酸钠亚硫酸钠溶液：取浓硫酸 2ml 加到
20、900ml 蒸馏水中，将此含酸蒸馏水加于盛有无水硫酸钠 208 克及无水亚硫酸钠 70 克，的烧杯中，边加边搅拌，待液解后全部移至 1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。取此溶液 1ml，加蒸馏水 24ml，检查其 pH，应为 7 或略高于 7，本试剂应贮于 25温箱中。2、双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO 45H2O）1.5 克及石酒石酸钾钠（C 4H4O6KNa4H2O）6 克，分别用适量蒸馏水溶解，混合后加入 10NaOH 溶液 300ml，最后加蒸馏水至 1000ml。3、标准血清：取经凯氏定氮标定后的血清用 15的 NaCl 溶液稀释 25 倍，贮于冰箱中备用。【注意事项】（一）硫酸
21、钠的溶解度与温度有关，温度低于 30易结晶析出，故室温较低时应在 37水浴或恒温箱进行保温。（二）血清样品必须新鲜，如有细菌污染或溶血，则不能得到正确的结果。（三）含脂类较多的血清，可用乙醚 3ml 抽提一次后再进行测定。五、 Folin酚试剂法（又名 Lowry）法目前实验室较多用用 Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在 15 分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。【原 理】蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅
22、与蛋白含量成正比。【操 作】1、标准曲线的制备：按下表操作，在试管中分别加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml 蛋白标准溶液，用生理盐水补足到 1ml。加入 5ml 的碱性酮试剂，混匀后室温放置 20 分钟后，再加入 0.5ml 酚试剂混匀。编 号 1 2 3 4 5 6蛋白标准（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.9% NaCl（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0碱性酮试剂（ml） 5 5 5 5 5 5混匀后室温(25)放置 20 分钟酚试剂（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.530 分钟后，以第 1 管为空白，在 650nm
23、波长比色，读出吸光度，以各客的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。2、血清蛋白质测定。稀释血清（或其它蛋白样品浓度）：准确吸取 0.1ml 血清，置于 50ml 容量瓶中，用生理盐水释释至刻度（此为稀释 500 倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以 1、2、3 号，按下表操作：编 号 测定管 标准管 空白管稀释标本(ml) 0.2 稀释标准液(ml) 0.2 0.9%NaCl(ml) 0.2碱性酮液(ml) 1.0 1.0 1.0混匀后于室温放置 20 分钟酚试剂(ml) 0.1 0.1 0.1混匀各管，30 分钟后，在波长 650nm 比色，读取吸光度。【计
24、算】1、以测定管读数查找标准曲线求得血清蛋白含量。2、无标准曲线时，可以与测定管同样操作的标准管按下式计算蛋白含量：血清蛋白含量（g%）【试剂配制】1、碱性酮溶液：甲液：Na 2CO32g 溶于 0.1mol/L NaOH 100ml 溶液中。乙液：CuSO 45H2O 0.5 克溶于 1酒石酸钾 100ml 中。取甲液 50ml，乙液 1ml 混合。此液只能临用前配制。2、酚试剂：取 Na2WO42H2O 100g 和 Na2MoO32H2O 25g，溶于蒸馏水 700ml 中，再加 85H 3PO4，50ml 和HCl（浓）100ml，将上物混合后，置 1500ml 园底烧瓶中温和地回流
25、10 小时再加硫酸锂（Ll 2SO2H2O）150g，水 50ml 及溴水数滴，继续沸腾 15 分钟以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml，然后过滤，溶液应呈黄色（如带绿色者不能用），置于棕色瓶中保存。使用标准 NaOH滴定，以酚酞为指示液，而后稀释约一倍，使最后浓度为 lN。3、蛋白标准液（0.1mg/ml）准确称取 10mg 牛血清蛋白，在 100ml 容量瓶中加生理盐水至刻度。溶后分装，放于20冰箱保存。【注意事项】1、Tris 缓冲液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、丙酮等均会干扰 Folin-酚反应。2、当酚试剂加入后，应迅速摇匀（加管摇一管）以免出现浑浊。3、由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红外光区呈现较宽吸收峰区。不同实验室选用不同波长，有选用 500 或 540nm，有选用 640nm，700 或 750nm。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选用波长 650nm。
