1、多元校正分光光度法同时测定混合色素一、 【实验目的】1. 利用分光光度法测定胭脂红、柠檬黄、日落黄三种有机色素混合液的吸光度。2. 利用多元校正法（线性代数知识）处理数据，计算 RSD 和 RSE、RSDt。3. 了解矢量数据的获取方法及其在多组分测定中的应用。4. 了解计算机技术及化学计量学基本方法在波谱解析中的应用。二、 【实验原理】1. 实验背景：食用合成色素是饮料等食品中的常用添加剂，但合成色素从合成工艺和结构上可能具有一定的毒性。因此，色素的种类、含量分析对食品工业具有重要意义。而胭脂红、柠檬黄、日落黄则是常见的食品着色剂。由于色素大多是有色有机物，对可见光有较强吸收，故采用分光光度
2、法是测定色素。对于混合色素，需要将各组分分离后，才能进行定量测定。而化学计量学方法（矩阵和线性关系）为混合色素不经分离，利用分光光度法进行准确地同时测定提供了可能。2. 实验原理：比尔定律：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度 A 与吸光物质的浓度 c 及吸收层厚度 b 成正比 .。公式：A=lg（1/T）=Kbc线性代数和矩阵：设有 nc个组分同时存在，配制一组已知样本共 ns个溶液，其浓度矩阵为Cncns，在 nw个波长下测得吸光度矩阵 Anwns。根据朗伯比耳定律有： (1) nscnwsnCK其中 Knwnc为吸光度矩阵，根据最小二乘法原理可求出各组分的纯物种谱
3、，即K 矩阵：(2) 1tt)(式（2）中 t 和-1 分别表示该矩阵的转置和逆。对于一个或一组未知样，同样在 nw个相同波长下测定后，可用最小二乘法根据下式求出未知物的浓度。(3)未t1t未AK)(C此计算过程由计算软件处理，最终可以获得实际操作中所配制的混合色素的物质组成、各色素的体积和偏差。三. 【仪器与试剂】722 分光光度仪（带四个比色皿） 、Agilent8453UV-VIS 分光光度仪、50ml 容量瓶 6 个、5ml 移液管 4 支、移液枪 4 支胭脂红溶液（120mg/L） 、柠檬黄溶液（100mg/L） 、日落黄溶液（100mg/L） 、HCl溶液（0.1 mol/L） 、
4、蒸馏水4、 【实验步骤】 按照各色素所加体积之和在 14-16ml，最大体积和最小体积在 3 倍以上，每种色素加入体积有起伏，设计三种色素加入体积表格：第一次实验： 第二次实验：No. 1 2 3 4 5 6胭脂红/ml 0 2 4 6 7 9日落黄/ml 6 10 0 2 5 7柠檬黄/ml 9 4 10 6 2 0 清洗容量瓶，开启仪器，洗洁精清洗比色皿。选取四组比色皿，以蒸馏水为参比，不断清洗至比色皿两两吸光度相差正负 0.02 以内，并以偏离最大者作为水/参比比色皿。 取 6 个 50ml 容量瓶，按照表格设计配制溶液，然后加入 5mlHCl，稀释至刻度，摇匀。任意选择几组采用移液枪，
5、实验结果出来后比较移液管和移液枪的精准度。 做参比的比色皿装 HCl 溶液或者蒸馏水，每次测定三组溶液，每三组一轮，从 390nm 测到 540nm，记录各组的吸光度。 输入数据，软件处理数据。分析自己的溶液体积实际值和理论值的误差，分析 RSD 和 RSE，利用多元校正，分析实验误差原因。 将溶液用 Agilent8453UV-VIS 分光光度仪测定，分析 RSE 和 RSD。5、 【实验数据和图谱】理论实验评价：RSD5.0 找出错误原因并重做。RSE 一般 2%以下为优秀，3%为良好，3%-6%为可以接受，超过太多且不能找出明显原因则需要重做.提高实验 RSD：No. 1 2 3 4 5
6、 6胭脂红/ml 0 6 11 2 8 4日落黄/ml 4 2 0 8 6 10柠檬黄/ml 10 8 6 4 2 0提高实验 RSE：提高实验去除一组：第一次实验 RSD：第一次实验 RSE：安捷伦仪器测定数据图：由于第一次实验未来得及测安捷伦仪器，bbs 上得到一份数据（1153610） ，得到相应的图谱和 RSD：0.00065 ，RSE：2.347、0.819、0.503。与手动仪器比较，RSD：0.00068，RSE： 1.232、1.114、1.439。从数据可以看出安捷伦仪器测量波长间隔为 1nm，比分光光度计更为精确，测量更为自动化，也更为简便，时间更短。从图谱也可以看出，安捷
7、伦仪器从 300nm 测到 600nm，比分光光度计测量波长范围更广，但对于 390nm 一下的短波长光，会有一个变化和拱起，所以在利用多元法时只需要从 390nm 开始测定到 540nm 即可。如果只取 390nm 到 540nm 范围数据，发现安捷伦仪器和分光光度计测得的图像基本吻合。但从实验结果（即 RSD 和RSE）来看，两者有明显不同，RSD 测量分别为 0.00065 和 0.00068，由于读数全自动，RSD 相差不多，但对于 RSE 来说，则安捷伦仪器则更能精确的反映配制溶液的差异。也就是说操作和读数相差不大时两者 RSD 往往差异不大，但对于 RSE 来说，体积的变化更为敏感
8、，少量溶液配制失误 RSE 迅速增大，其检测意义的重要性不能忽视。所以不能只看RSD 小就可以了，RSE 小，且 RSDt 也是一个重要的参数。取 390nm-540nm 波长范围的图像：6、 【结果分析和讨论】A 平 的计算：根据公式： )10ln(expRSD)10ln(SAT把 166 个 A 取平均值后换算得到第一次实验：A 平 =0.5387 ；第二次实验：A 平 =0.5195，从而计算出 RSDT：第一次实验 RSDT=9.92410-4；第二次实验 RSDT=1.03710-3最终数据：RSDA 胭脂红 RSE 柠檬黄 RSE 日落黄 RSE RSDT第一次实验 0.00149
9、 2.025% 4.569% 6.751% 9.92410-4第二次实验 0.00058 0.678% 1.988% 3.862% 1.03710-3RSD、RSE 结果分析：第二次实验 RSD=0.00058，相对于第一次实验 RSD=0.00149 有进步。原因主要是比色皿的清洁度，第一次洗了将近一个小时还是差异很大，第二次直接用超声波洗过的、别人用过的比色皿，四个比色皿基相差本都在 0 左右。而且这一次读数和旋旋钮时更为注意，推拉杆的时候，待位置卡准后，前后有两次读数，基本读数波动误差排除。而第二次实验 RSE 分别为：胭脂红 0.678%、日落黄 1.988%、柠檬黄 3.862%，相
10、对一第一次实验：胭脂红 2.025%、日落黄 6.751%、柠檬黄 4.569%，有较大进步，但还是柠檬黄配制溶液时偏大。可能的原因是第二次实验基本都是用移液枪，更为便捷精确，但可能移液枪老化，容易按到底，同时移液枪外壁的溶液误差都会导致还是有较为明显的误差。7、 【实验体会】经过两次实验的对比和查询资料，尤其是登陆 bbs 查看往届学长学姐的体会和总结，发现了很多值得注意和总结的地方。总的来说就是每一个细节都要注意，最终都可能极大的影响实验结果。1. 比色皿的清洗：比色皿间的差异越小对 RSD 的测量越准确，所以为了达到0.002 的相对值，需要长时间清洗比色皿，不断测试直到合格。往往为了达
11、标，除了水洗，还会用少量洗洁剂清洗（软毛刷） ，甚至更换比色皿。第一次实验清洗比色皿就花了1h 左右，误差仍然较大。第二次直接用前人用过的，由于已经用超声波清洗，四个比色皿差别基本没有，RSD 也大大降低。2. 波长的调节和吸光度的测量：首先是仪器调零：先调节 T=100,然后打开盖子,调节左下第二个旋扭使 T=0,最后换到 A 档,消零。还有就是每次变换波长后都要把右上角调回 T 档检查是否为100.0（或者 A=0） 。在改变波长时需要注意不要旋转幅度过大导致超过，这会带来误差，波长精确度高会大大降低 RSD。3. 移液管和移液枪等：RSE 反映了体积的误差，在后面会详细分析可能的体积误差
12、原因。在这里主要说明一下移液枪和移液管的对比和使用。就误差来说，用移液器的比较小，也比较便捷快速。在 bbs 上面看到学长等讨论：“用移液器的比较小，用移液管的 RES 一般都在 4%左右，大概是在使用移液管的时候视线没有平视造成的误差。 ”但移液管由自己控制，不准确的原因和影响因素容易了解和修正，而使用移液枪则容易受到移液枪老化、腐蚀而导致体积出现误差（就是没有卡住的地方，很容易在吸取溶液的时候按到底） ，不可控因素大。还有可以只用一个移液枪来移取溶液：枪头标号后，每次使用都应该把枪头拿下来，再套上另外一个枪头移取溶液，但需要注意不能在没有拔下枪头前把移液枪倒置和平放，否则会造成移液枪被腐蚀
13、，不再精确。4. 拉杆的使用：拉杆不能马虎，稍不卡准数字就跳动很大，所以万不能贪快而随意。可以再测定过程中拉回参比溶液，重新测定，同时注意拉到合适位置时候的声音，另外拉到一个位置时候其实前后稍微可以活动，最后如果实在调动的话，就要看在哪个数字停留时间较长。5. 体积的设计：体积设计要求：线性不相关（才能构成线性方程求出特征值和秩） ；要求同一种物质在不同组别里体积有变化，最好有 4 倍以上的变化幅度；每一组溶液总体积应控制在 12-16ml。6. 天气和时间、熟练度：天气干燥、温度较高往往结果更精确，可能是仪器会受湿度、温度影响而产生波动；发现第二次实验比第一次实验普遍操作时间缩短，结果更为精
14、确，说明熟能生巧。7. 防气泡小窍门：在实验过程中，不能有气泡，会对吸光度有影响。但我总是有气泡贴在比色皿内壁，后来问学姐学会了一招：洗气瓶尖嘴贴住内壁让水顺着内壁流不会有气泡。八、 【介绍 RSE 和 RSD、cosa 和线性代数与矩阵】RSE 和 RSD：RSD 是 Residual Standard Deviation ，不是相对标准偏差，而是剩余标准残差。RSD 反映大家的实验操作水平、准确度、精确度，残余标准偏差 RSD 越小，吸光度测量的误差越小。RSE 即 Relative Standard Error，是相对标准误差。RSE 反映了大家配制溶液的精确度、准确度和操作水平。RSD
15、 到可以看作仪器及操作等因素的精密度(波动范围)的标志，RSE 恰恰与准确度相对应。公式：线性代数与矩阵：针对矩阵知识，三种物质相当于三个未知量 X，通过一系列线性无关的配比，测定其吸光度 Y，得到不同的线性组成（类似线性方程组） ，从而可以求出三种物质浓度的特征解。Cos 和相关程度：（查找资料，仅是自己的看法，未经证实）线性相关系数又称皮氏积矩相关系数，是衡量两个随机变量之间线性相关程度的指标。r 取值范围为-1,1，r0 表示正相关，r0 表示负相关，|r|表示了变量之间相关程度的高低。针对两组数据组，可以求出 X、Y 的线性相关度。公式：但本实验中要求各行不相关所利用的相关程度 cos
16、 不同于 r。k 1+ k2。 就称 为 ， 的线性组合。满足 k1 1+ k2 2+ + kmm=0 时，称各向量线性相关。把 6 组溶液看做向量，要求平行组分线性不相关，即向量间两两不相关，即 k1 k2。从向量的角度，即两个向量重叠度小，即cos 越接近 0（向量间夹角接近 90） ，相关度越小。向量内积公式（A、B 为向量，A,B为向量内积，|A|为向量的模（大小） ）：Cos 可以看做向量间的夹角，也可以说向量的平行程度（应用到实际中即变|*|,cos量或者数据的相关程度）K 矩阵：通过 K 矩阵模板得到的 K 矩阵和图像，计算公式： 1tt)(CAK第二次实验：K 矩阵10.06
17、20.46 54.71 11.63 22.56 62.91 12.85 24.16 68.92 14.57 25.36 72.84 16.60 27.03 74.27 18.68 30.84 71.98 22.69 37.66 66.08 28.79 44.71 54.50 36.49 51.93 41.82 44.19 56.92 29.28 51.37 55.85 14.90 56.21 53.06 5.82 57.63 47.78 2.47 55.33 33.84 1.08 49.93 16.98 0.43 41.87 5.49 0.58 第一次实验：K 矩阵10.83 17.90 56
18、.06 12.99 19.83 63.78 14.02 21.30 70.43 16.15 22.27 74.66 18.51 23.45 76.06 21.03 27.32 74.14 24.89 33.52 67.36 31.22 40.06 54.96 39.54 47.48 41.79 47.26 52.04 27.54 53.43 50.97 13.68 57.97 48.51 4.65 59.28 43.37 1.24 55.42 30.78 0.42 50.19 14.52 -0.27 41.38 4.50 -0.47 9、 【软件探索】通过软件分析：除了最简单直接的分析 RSD
19、 和 RSE 之外，还可以通过其他方法和按钮来告诉一些其他信息（以第一次实验为例） ，但由于对操作界面不熟悉，以及一段时间的遗忘，一部分界面操作和认识不熟悉。SD vs sample 和 SD vs wavelength 能做出两个图像，但具体应用不太清楚，其他偶尔也操作出不同的图，但代表什么含义和作用不太明白。自己的一些分析：1. i/i+1 出现的突峰和 RAS&MAX（R）平线对应的位置来来找出噪声最大点（偏离特征值最大的点）是第几组溶液。软件可以直接告诉实验最大的误差时第几组及多少波长位置；2. 软件可以给出三种纯物质的光谱图，并和 6 组溶液对比；（可以得到柠檬黄吸收光谱最短，其次是
20、日落黄，胭脂红吸收光谱最长）3. 给出 RSE 图像时会给出一个配制溶液的设计值和计算值的差异来看出配制溶液过程中是否有误差以及是何种误差，同时从表格中可以找出配制溶液中的失误和误差，部分情况可以加以修正。常见失误：少加某种溶液、重复加入溶液、所加溶液与组分不配套、溶液加混（加错） 、溶液顺序加错或者记错、溶液加入仪器或者操作误差等。以及在操作移液管和移液枪时的一些小的不规范引起的误差：移液器的错误使用方法，就是把液体压出的时候拇指有所转动，完毕以后会发现移液器的刻度发生了 0.05 的变化，如果没有及时发现的话，下一次吸液便会有误差（但不影响第一次） 。往往有同学将溶液吸上来以后，尖嘴处会有一段空隙，这样的空隙的存在是会影响结果的（其生成的原因可能是吸取好以后，移液器的倾角过大所致，所以尽量使移液器保持竖直） 。由于台面高度过低，移液管的时候视线没有平视造成的误差。-来自实验体会和 bbs 帖子4.从 6 组溶液的光谱图中也可以大概看出，越平滑的曲线 RSD 越小，有尖峰的往往误差大，同时可以大概看出在哪组、哪个波长处出现误差；5.对于“R&N”键，和“detect outlier”可以用于交叉验证，即剔除一组看RSE 或者光谱图的变化，如果下降得厉害的说明该组分配制有问题，如果上升的厉害的说明该组分配制没有问题；
