1、谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定一、实验目的掌握茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理和方法,测定谷物种子蛋白质中赖氨酸含量。二、实验原理 蛋白质中的赖氨酸具有一个游离的 -NH2，它与茚三酮试剂反应生成蓝紫色物质，其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸的含量成线性关系。因此，用已知浓度的游离氨基酸制作标准曲线，通过比色分析（530nm）即可测定出样品中的赖氨酸含量。亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，而且仅有个游离氨基(-NH 2)，所以通常用亮氨酸配制标准液。但由于这两种氨基酸分子质量不同，以亮氨酸为标准计算赖氨酸含量时，应乘以校正系数 1.1515，最后再减去样品中游离氨基酸含量。 三、实验仪器 1电子
2、分析天平（1/1000 ）、可见分光光度计、恒温水浴箱、干燥器、移液器。2试管架（塑及铝）、具塞试管、具塞三角瓶、细口瓶、漏斗（或 0.45um滤膜）、吸管等。四、实验试剂10.4mol/L 柠檬酸缓冲液：称取 4.202g 柠檬酸和 5.88g 柠檬酸三钠，溶于 100ml 蒸馏水中。2 茚三酮试剂：称 40mg 二氯化锡( 防腐)溶于 25ml 柠檬酸缓冲液中；称 lg茚三酮溶于 25ml 95乙醇中；将上述两液混合摇匀，滤去沉淀，上清液置冰箱中保存备用。 30.02mol/L 盐酸：取 12mol/L 盐酸 0.17ml，用蒸馏水稀释定容至100ml。4亮氨酸标准液：准确称取 20mg
3、亮氨酸，加数滴 0.02mol/L 盐酸使之溶解，然后用蒸馏水稀释定容到 100ml，则得浓度为 200gml 的标准液。560乙醇。64碳酸钠：称取 4g 无水碳酸钠，溶于 100 ml 蒸馏水。72碳酸钠。五、操作步骤1标准曲线的制作。 取 7 支具塞试管，按表进行编号、加入试剂，顺序操作。以第 1 管为空白，在530nm 波长下比色，读取吸光度值。并以吸光度值为纵坐标，亮氨酸含量（g）为横坐标，绘制标准曲线。2样品前处理不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过 80100 目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶中，加入沸程 60 90 的石油醚，使其淹过粉面，浸泡 8小时，不时摇动进行脱脂。然
4、后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉凉在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置于干燥器内，保存备用。3样品的测定取 15mg 已粉碎脱脂的玉米样品于具塞干燥试管内，加 2碳酸钠 1.0ml，于80水浴中提取 20min，然后加茚三酮试剂 2.Oml，继续保温显色 30min，冷却后加 60乙醇 3.Oml，混匀后过滤或离心，然后在 530nm 波长下比色。六、实验结果 样品中赖氨酸的含量（%）=从标准曲线上查得值（ g）10 -3/(样品重 mg)1.1515100%-C校正系数：1.1515 ；C：游离的氨基酸含量七、注意事项 1各种作物种子中游离氨基酸含量是
5、：玉米 0.01、小麦 0.05、水稻0.01、高粮 0.04。 2茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色。标准曲线的制作及样品测定参考表试 管 号试 剂 1#(空白) 2# 3# 4# 5# 6# 7#(样品)亮氨酸标准液(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水(ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 亮氨酸含量(g) 0 20 40 60 80 100 4碳酸钠(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 脱脂样品(mg) 152碳酸钠(ml) 1.0 8
6、0水浴 20分钟茚三酮试剂(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0混匀，加塞，80水浴 30 分钟，冷却至室温60乙醇(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 过滤混匀A530 蛋白质中赖氨酸（lysine，Lys）的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法（Dye Binding Lysine，DBL）测玉米种子中赖氨酸含量。一、茚三酮显色法原理： 谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的 -NH2，它与茚三酮（ninhydri
7、n）试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量. 二、材料、仪器设备 （一）材料：不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过 100 目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶内，加入沸程 6090的石油醚，使其淹过粉面，浸泡 8h，不时搅动进行脱脂。然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置干燥器内，保存备用。 （二）仪器设备：1. 722 型分光光度计； 2. 水浴锅；3. 试管；4. 圆头玻璃棒（圆头大小要与试管大小配套） 。 （三）试剂：1. 缓冲溶液，称取 30g 甲酸钠，溶解于约 60ml 蒸馏水中，加入 10ml8的甲酸，最后加水到 100ml；2.茚三酮试剂，称取 1g 茚三酮和 1g 氯化镉（CdCl 2.H2O） ，加入 25ml 上述缓冲溶液和 75ml 乙二醇，室温下放置一天，第二天使用。若出现沉淀，则过滤后使用。该溶液一定要头一天配制，第二天使用，不宜
