1、三种荧光定量 PCR检测方法比较定量 pcr：以参照物为标准，对 PCR 终产物进行分析或对 PCR 过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量 PCR。定量 PCR 的可行性定量一般是在 PCR扩增的指数期进行的。常见 荧光定量 PCR 检测方法可分为以下几类：(1) SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链 DNA 结合发光的荧光染料。其与双链 DNA 结合后，荧光大大增强。因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。 SYBR Green I 的最
2、大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm。PCR 扩增程序一般为 945572三步法，40 个循环。SYBR Green I 的缺点：由于 SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对 PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链 DNA 相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。(2)
3、水解探针模式(taqman 探针 )TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的 5末端， 而淬灭剂则在 3末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的 5外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此 Taqman 探针检测的是积累荧光。 PCR 扩增程序通常是：9460 40 个循环。常用的荧光基团是 FAM，TET，VIC，HEX 。(3) 杂交探针模式(Beacon、FRET)分子信标是一种呈发夹结构
4、的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补 ;茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发
5、出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。PCR 扩增程序通常是：94 55 72 三步法，40 个循环。FRET 探针又称双杂交探针，FRET 探针由两条相邻探针组成，在一条探针的 5端标记 FAM 荧光基团，另一探针的 3端标记 Red 640 荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM 基团和 Red640 基团相邻，激发 FAM 产生的荧光，作为 Red640 基团的激发光被吸收，使 Red640 发出波长为 640 的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生 640 波长的荧光。由于 FRET 探针是靠近发光，所
6、以检测信号是实时信号，非累积信号。常用的荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705。能用于实时荧光 PCR 定量的方法很多，各有优缺点，应根据实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方法。下面为各种方法的比较：实验中的一些好习惯：加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。一定要记着关水浴箱，切记切记;多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了;所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因。防止 RNA 酶污染的措施：1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180的高温下干烤 6h 或更长时间。2. 塑
7、料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用)。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在 3% H2O2 室温 10min，然后用 0.1% DEPC 水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC，在 37处理 12h 以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22m滤膜 过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置 RNA 操作专用 实验室，所有器械等应为专用。常用的 RNA 酶
8、抑制剂：1. 焦磷酸二乙酯(DEPC) ：是一种强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。它通过和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA 酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对 RNA 酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和 RNA 酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制 RNA 酶的活性。4. RNA 酶的蛋白抑制剂(RNasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是 RNA 酶的一种非竞争性抑制剂
9、，可以和多种 RNA 酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对 RNA 酶也有一定抑制作用。因为 DEPC 不加选择的修饰蛋白质和 RNA，因此在分离和纯化 RNA 过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如 Tri)不能相容在所有 RNA 实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA 酶)的污染。RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染 RNA 酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行 RNA 实验时应勤换手套。但 DEPC 能与胺和巯基反应,因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理
10、动植物总 RNA 提取-Trizol 法：Trizol 法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用 Trizol 法提取的总 RNA 绝无蛋白和 DNA 污染。 RNA 可直接用于 Northern 斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。1. 将组织在液 N 中磨成粉末后，再以 50-100mg 组织加入 1ml Trizol 液研磨，注意样品总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10%。2. 研磨液室温放置 5 分钟，然后以每 1mlTrizol 液加入 0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡
11、离心管 15 秒。3. 取上层水相于一新的离心管，按每 ml Trizol 液加 0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置 10 分钟，12000g 离心 10 分钟。4. 弃去上清液，按每 ml Trizol 液加入至少 1ml 的比例加入 75%乙醇，涡旋混匀，4下 7500g 离心 5 分钟。5. 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥 5-10 分钟，注意不要干燥过分，否则会降低 RNA 的溶解度。然后将 RNA 溶于水中，必要时可 55-60水溶 10 分钟。RNA 可进行 mRNA 分离，或贮存于 70%乙醇并保存于-70。注意1. 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操
12、作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值2. 加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA 沉淀在 70%乙醇中可在 4保存一周，-20 保存一年。总 mRNA 的提取经验：一、 关于 Trizol Reagent 需要的试剂1. Chloroform：氯仿 (分析纯 )2. Isoproplyl alcohol：异丙醇 (分析纯)3. 75% Ethanol(in DEPC-treated water)：75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的 DEPC 处理过的无 Rnase 的水稀释。4. RNase-free water
13、：无 Rnase 的水。方法是：将 DEPC 按 0.01%(V/V)加在 d H2O中 500ml(50ul)，在 37过夜，并高压灭菌即得 (150 3 小时)5. 一次性塑料手套6. 注意：DEPC 有致癌之嫌二、 关于 Trizol Reagent 的使用过程：1. Homogenization(匀浆)a. Tissues：组织每 100mg 组织匀浆加 1mlTrizol 试剂，样品体积不能超过 Trizol 试剂的 10%。b. Cells Grown in monolayer(单层细胞接毒后出现病变的 )针对 JEV 细胞总 RNA 的抽提法：BHK21 细胞长成单层后，接毒 0
14、.5-1ml(采用大瓶)，37 吸附 1h，倒掉，加维持液(含 2%的血清和 HEPE8 的 MEM)约 5ml，维持天。出 现 75%-100%的病变时，以PBS(预冷) 冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入 Trizol 试剂 1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞( 细胞瓶有两 种常用规格：大的约 45cm2，小的约 30cm2，故所用 Trizol 试剂分别约为 4.5ml 和 3ml。Trizol 试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶 底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致 DNA 的污染)具体方法如下：(样品一定要新鲜)(1) 组织接入预冷的 EP 管中，加入 Trizol 试剂 1
15、ml/10cm2(量一定要加足，否则易污染)，混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温 5min，以使核蛋白复合物彻底分离。(2) 加氯仿 0.2ml(每 1ml Trizol 试剂加入氯仿 0.2ml)，盖好，剧烈震荡 15s，置室温2-3 分钟。(3) 4离心，10000g15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA 包含在水相中，水相的体积约相当于所加的 Trizol 试剂量的 60%。(4) 仔细吸取上层水相，移至另一 EP 管中。(5) 加 0.5ml 异丙醇，以沉淀 RNA(每 1ml Trizol 试剂加入 0.5ml 异丙醇)，置室温10
16、min。(6) 4离心，10000g10min。RNA 沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。(7) 弃上清液，加入预冷的 75%乙醇 1ml(每 1ml Trizol 试剂加入 75%乙醇至少 1ml)，震荡，充分洗涤沉淀，4离心，5500g5min。弃上清液，空气干燥 (或真空干燥)后，沉淀重悬于无 Rnase dH2O 中，吹吸几次，55-60作用 10 分钟以溶解 RNA，-70保存备用。(8) 抽提出的细胞总 RNA 干燥后加水 50ul，取 10ul 加无 Rnase 水 990ul，稀释 100倍成 1ml。于 0.5cm 厚的石英比色杯中，以无 Rnase 水为对照，在
17、721 型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio1.6。(9) 分离组织 10mg(纯组织)加 800ul Trizol 试剂。(10) 扩增产物的鉴定。DEPC 处理方法如下：1. DEPC 处理：(1)DEPC 水： 100ml 超纯水加入 0.2ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。(2)Tip 头(枪头)、EP 管等在提 RNA 过程中及做 RT 时接触 RNA 的器材(包括1ml、200l、20l Tip 头;EP 管和 PCR 反应管等) ：用 0.1%的 DEPC 水(1000 ml 超纯水加入 1ml DEPC)37浸泡过夜，高压灭菌。2. 提取 RNA，用
18、 DEPC 水溶解。3. RT：我是用 PCR 仪来控制温度和时间的，所以 RT 是在 PCR 反应管中作的。4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。最好把要直接接触样品的东西都用 DEPC 水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入 1-2ml 的 0.1%DEPC 水，在灭菌就行了; 现在有进口的 RNASE FREE 的枪头买，直接用不用处理的。如何消除污染：机器运行完后，取出 PCR 产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。(1) 试剂：mixer 尽量分装，不要原瓶多次取用。(2)加样：原则是 DNA 最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针
19、有多管的话只是 DNA 不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了 UNG 来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase(UNG)尿嘧啶 DNA 糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。RNA 定量：RNA 也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较 不同标本之间就更不准了。RNA 的贮
20、藏，最主要的是温度，-20 不够，最好-80，液氮最保险。mRNA 是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和 RNA 降解速度的影响。RT-PCR 有两种做法：条件具备的话可用 kit 进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，由此推测是体系更加单一比较利于 PCR 的进行。一定要做内参的，不作内参的结果是不可信的。电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量 RT-PCR 做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量 mRNA 的分离与纯化中。步骤(4)中将 RNA 溶液置 65中温育然后冷却至室温再上样的目
21、的有两个，一个是破坏 RNA 的二级结构，尤其是 mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使 Poly(A+)尾充分暴露，从而提高 Poly(A+)RNA 的回收率 ;另一个目的是能解离 mRNA 与 rRNA 的结 合，否则会导致 rRNA 的污染。所以此步骤不能省略。下面，我们介绍一个可以确认 RNA 溶液中有没有残留的 RNA 酶的方法。保温试验：方法很简单的，按照样品浓度，从 RNA 溶液中吸取两份 1000 ng 的 RNA 加入至 0.5 ml 的离心管中，并且用 pH7.0 的 Tris 缓冲液补充到 10 ul 的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入 70的恒温水浴中，保温
22、1 h。另一份放置在-20冰箱中保存 1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别( 当然，它们的条带也要符合方法 2 中的条件)， 则说明RNA 溶液中没有残留的 RNA 酶污染，RNA 的质量很好。相反的，如果 70保温的样本有明显的降解，则说明 RNA 溶液中有 RNA 酶污染。PCR 污染与对策：PCR 扩增产物污染.这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。还有一种容易忽视，最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反
23、应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备;2. PCR 扩增区，包括反应液的配制和 PCR 扩增;3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备PCR扩增产物分析产物处理。切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染;操作多份样品时，制备反应混合液，先将 dNTP、
24、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。反应液污染可采用下列方法之一处理：DNase I 法：PCR 混合液(未加模板和 Taq 聚合酶)加入 0.5U DNase I，室温反应 30 min 后加热灭活，然后加入模板和 Taq 聚合酶进行正常 PCR 扩增。该方法的优点是不需要知道污染 DNA 的序列;尿嘧啶糖苷酶(UNG) 法：由于 UV 照射的去污染作用对 500bp 以下的片段效果不好，而临床用于检测的 PCR 扩增片段通常为 300bp 左右，因此 UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。1、提取 mRNA 时所用的 EP 管、玻璃等器皿全部都要用 0.1%DEPC 水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。2、用 DEPC 水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用 DEPC 处理还有什么意义呢?还要用双蒸水洗吗?3、玻璃器皿干烤：180 度， 8 小时或更长时间; 小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。
