1、实验一 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色
2、的 3-氨基-5- 硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在 540 nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料 小麦面粉(1000 g) 2主要仪器 （1）具塞玻璃刻度试管：20 mL11 （2） 滤纸 （3）烧杯：100 mL2 （4）三角瓶：100 mL1 （5）容量瓶：100 mL 3 （6）刻度吸管：1mL1；2 mL2； 10 mL1 （7）恒温水浴锅 （8）煤气炉 （9
3、）漏斗 （10）天平 （11）分光光度计3 试剂（1）1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取 80 烘至恒重的分析纯葡萄糖 100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100 mL，混匀，4冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取 6.5 g DNS 溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL 容量瓶中，加入 2 mol/L 氢氧化钠溶液 325 mL，再加入 45 g 丙三醇，摇匀，冷却后定容至 1000 mL。 （3）碘-碘化钾溶液：称取 5 g 碘和 10 g 碘化钾，溶于 100
4、mL 蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取 0.1 g 酚酞，溶于 250 mL 70%乙醇中。（5）6 M HCl 和 6 M NaOH 各 100 mL。（分别取 59.19 mL 37 %浓盐酸和 24 克 NaOH定容至 100mL） 四、操作步骤1. 制作葡萄糖标准曲线取 7 支 20 mL 具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1 mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5-二硝基水杨酸（ DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表 1 葡萄糖标准曲线制作管 号 1mg/mL 葡萄糖标准液（mL ） 蒸馏水（mL ） DNS（mL） 葡萄糖含量 （mg） 光密度值 （OD 5
5、40nm）0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5 min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至 20 mL，加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至 540 nm，用 0 号管调零点，等后面710 号管准备好后，测出 16 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 葡萄糖标准曲线葡萄糖含量（mg）光密度值2. 样品
6、中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取 3.00 g 食用面粉，放入 100 mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入 50 mL 蒸馏水，搅匀，置于 50 恒温水浴中保温 20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在 100 mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。（2）总糖的水解和提取准确称取 1.00 g 食用面粉，放入 100 mL 三角瓶中，加 15 mL 蒸馏水及 10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加热水解 30 min, 取出 12 滴置于白瓷板上，加 1 滴 I-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷
7、却至室温后加入 1 滴酚酞指示剂，以 6 mol/L NaOH 溶液中和至溶液呈微红色，并定容到 100 mL，过滤取滤液 10 mL 于 100 mL 容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释 1000 倍的总糖水解液，用于总糖测定。（3）显色和比色取 4 支 20 mL 具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5 min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至 20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540 nm，用 0 号管调零点，测出710 号管的光密度值。表 2 样品还原糖测定管 号 还原糖待测 液（mL） 总糖待测
8、液（mL） 蒸馏水（mL ） DNS（mL）光密度值（OD-540nm）查曲线葡萄糖量（mg）平均值7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1 1 1.5 10 1 1 1.5 五、结果与计算计算出 7、8 号管光密度值的平均值和 9、10 管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量(以葡萄糖计) 。提取液总体积查曲线所得葡萄糖毫克数 测定时取用体积还原糖（%）=样品毫克数 100 =六、注意1. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。2. 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、思考题1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓 HCl 处理？而在其测定前，又为何要用 NaOH中和？2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设 0 号管有什么意义？3. 绘制标准曲线的目的是什么？查曲线所得水解后葡萄糖毫克数稀释倍数总糖（%）=样品毫克数0.9100 =
