1、细菌内毒素检查法,2011.03,一、基本概念,细菌内毒素与热原的关系热原(Progen) 指临床上能使哺乳类动物产生热原反应的物质。关于热原的定义在学术上还有争论。细菌内毒素(Endotxin) 革兰氏阴性细菌细胞壁的构成成分，具有多种生物活性，其化学结构是脂多糖(LPS)。热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但在GMP的条件下，在药检的范畴里，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就控制热原。,一、基本概念,细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中的细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括两种方式，即凝胶法和
2、光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。,一、基本概念,细菌内毒素的量用内毒素单位(EU或IU)表示。细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏 度复核、干扰试验及各种阳性对照。,一、基本概念,细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰的灭菌注射用水。试验所用的
3、器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250干烤30分钟以上，也可以采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。试验操作过程应防止微生物的污染。,二、细菌内毒素检查法(凝胶限量法),细菌内毒素检查法（凝胶法）实验程序如下：一、实验准备：试剂、仪器、及用具等二、确定药品的细菌内毒素限值（L）三、计算供试品的最大有效稀释倍数（MVD）或最低有效浓度（MVC）四、鲎试剂灵敏度复核五、药品与鲎试剂相容性的初筛试验六、供试品干扰试验以及干扰试验的验证七、供试品日常的内毒素限量检查。,三、实验准备,1. 仪器、设备 371恒温水浴或适宜的恒温器具2.器具：凡与供试品或试剂直接接触的器具
4、必须经除热原处理（250干烤30min以上）;塑料用具须确证不干扰实验结果. 3.试剂 内毒素工作标准品、 鲎试剂、 鲎试验用水、 PH调节剂。,四、确定药品的细菌内毒素限值（L）,L =K/M L:供试品的内毒素限值,可从药典上查询或按以上公式计算,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示K:按照规定的给药途径,人体每公斤体重每小时可接受的最大内毒素剂量,以EU/(kg.h)表示;M:人体每公斤体重每小时最大用药剂量,以ml(kg.h)、mg(kg.h)或U(kg.h)表示，中国人均体重按60公斤计算，人体表面积按1.62m2计算。按注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表剂量乘
5、以0.027即可转换为每千克体重剂量（M)。,五、鲎试剂灵敏度复核,1.鲎试剂灵敏度定义：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。2.目的 2.1考察鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确， 2.2考察试验人员操作方法是否正确和试验条件是否符合规定。3.鲎试剂灵敏度复核的条件 3.1使用新批号的鲎试剂， 3.2试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时。,五、鲎试剂灵敏度复核,4.溶液配制 注：A 为内毒素水溶液系列；B为阴性对照,五、鲎试剂灵敏度复核,5.反应加样6.结果判断：反应管倒转180 阳性(+)：凝胶不变形，不从
6、管壁滑脱者 阴性(-)：无凝胶或凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者,五、鲎试剂灵敏度复核,试验有效性判断 NC管必须全部为阴性(- -) TAL与内毒素水溶液系列： 2管均为阳性(+ + + +)， 0.25管均为阴性(- - - - ) 符合以上条件试验有效,五、鲎试剂灵敏度复核,结果计算 鲎试剂灵敏度的测定值(c)计算： c =antilg(X4) X为反应终点浓度的对数值(lg)。 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当0.5c2时，以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。,六、鲎试剂灵敏度的选择,一般为了试验的方便，选择灵敏度低的鲎试剂，若供试品的限值很小，则应选择灵
7、敏度高的鲎试剂，方便供试品溶液的稀释和PPC（供试品阳性对照）的制备。,七、供试品溶液的制备,供试品溶液的最大稀释倍数的计算 MVDCL/ L:供试品的内毒素限值； C：供试品溶液的浓度； 当L以 EU/ml表示时，C为1ml/ml;当L以EU/mg或EU/u表示时，C的单位为mg/ml或u/ml(注意：当L以EU/ml表示时，C的值不是样品的浓度，就是1)。,七、供试品溶液的制备,某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0 8.0的范围内。(USP、EP一般要求供试品溶液与鲎试剂的混合液的PH值在6.0 8.0的范围内。） 对于过酸、过碱或
8、本身有缓冲能力的供试品，需要调节被测溶液(或其稀释液)的PH值。,八、药品与鲎试剂相容性初筛试验,1.目的： 通过一系列浓度的试验，筛选出对鲎试验无干扰的浓度 2.作用： 确定以后对样品作BET常规检查的两个主要参数： 样品的有效稀释范围或有效浓度范围， 可选择的鲎试剂的灵敏度范围。 减少干扰试验的盲目性 节省时间以及成本。,九、供试品的干扰试验,1.目的：判断某种检品在某种浓度下是否适合作内毒素检查。 2.原理：比较鲎试剂与内毒素的反应在水溶液中进行和在检品中进行的差异,也即是比较反应在不同介质中进行反应的差异,无差异即无干扰,有差异即有干扰。若没有干扰，该浓度可以进行日常检查；若有干扰，则
9、必须排除干扰后才能进行日常检查。,九、供试品的干扰试验,3.在何种情况下需做干扰试验： 新品种建立方法 鲎试剂的来源改变 鲎试剂的配方、生产工艺改变 供试品的来源改变 供试品的配方、生产工艺改变 试验环境中发生了其它有可能影响试验结果的变化。,九、供试品的干扰试验,注：A为阴性对照；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为供试品溶液 USP、EP规定为4支平行管,凝胶法干扰试验溶液的制备,九、供试品的干扰试验,加样反应,十、干扰试验结果分析,试验有效性判断 -NC管必须全部为阴性 -供试品管必须为阴性 -TAL与内毒素水溶液系列： 2管均为阳性(+)， 0.25管均为阴性(- -
10、 - - ) 即0.5Es2 符合以上条件试验有效。,十、干扰试验结果分析,按下式计算系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et) Es=antilg(Xs4) Et=antilg(Xt4) Xs和Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(lg)。当0.5Es2且0.5EsEt2Es 时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。 USP、EP规定当0.5Es2且0.5Et2时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。,十、干扰试验结果分析,反应结果1(SD表示供试品溶液)E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC Es + + - - - - - - - - - - 0.2
11、5EumlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC Et + + - - - - - - - - - - 0.25Euml 0.5 Es 2且Es=Et,干扰成立,十、干扰试验结果分析,反应结果2：E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC Es + + + - - - - - - 0.125EumlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC Et + + - - - - - - - - - - 0.25Euml 0.5 Es 2且Et=2Es,干扰成立,十、干扰试验结果分析,反应结果3：E0.5 E0. 25 E0.1
12、25 E0.06 NC Es + + - - - - - - - - - - 0.25EumlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC Et + + + - - - - - - 0.125Euml 0.5 Es 2且 Et =0.5Es,干扰成立,十、干扰试验结果分析,反应结果4：增强E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC Es + + - - - - - - - - - - 0.25EumlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC Et + + + +- - - - - 0.104Euml按中国药典判断：试验有效
13、，但内毒素供试品溶液系列不符合 0.5EsEt2Es ，则认为干扰试验不成立，即供试品在试验浓度下有干扰作用。 按USP、EP判断:内毒素供试品溶液系列0.25管（SDE0.5）中有一管呈阳性,不符合0.5Et2的要求,则认为干扰试验不成立，即供试品在试验浓度下有干扰作用。,十、干扰试验结果分析,反应结果5：增强E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC Es + + + - - - - - - 0.125EumlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC Et + + + +- - - - - 0.104Euml按中国药典判断:试验有效，符合 0.5
14、Es2且0.5EsEt2Es ，则认为干扰试验成立,即供试品在试验浓度下无干扰作用。按USP、EP判断: 内毒素供试品溶液系列0.25管（SDE0.5）中有一管呈阳性,不符合0.5Et2的要求 ，则认为干扰试验不成立,即供试品在试验浓度下有干扰作用。,十、干扰试验结果分析,反应结果6：抑制E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC + + - - - - - - - - - -SDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC +- - - - - - - - - - - - - - -内毒素供试品溶液系列2管（SDE0.5）中有一管呈阴性，供试品在该浓度下对
15、凝胶反应有抑制作用。,十、干扰试验结果分析,反应结果7：抑制E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC Es + + + - - - - - - 0.125EumlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC Et + - - - - - - - - - - - - - - 0.5Euml按中国药典:0.5 Es 2但 Et 2Es,干扰不成立。认为供试品在试验浓度下对凝胶反应有抑制作用.按USP、EP:0.5 Es 2且0.5 Et 2 干扰成立。认为供试品在试验浓度下对凝胶反应无干扰作用.,十一、举例：某产品的干扰试验,1.试剂,十一、举例：某产品的
16、干扰试验,2.制备某产品供试品溶液某产品内毒素限值L0.6EU/mg最大有效稀释倍数MVD=(4mg/ml0.6EU/mg)/0.25EU/ml=9.6选择稀释倍数为8倍,则其供试液的浓度为0.5mg/ml。供试液(S8)的制备 2.0ml供试品+13.4mlBET水+0.6mlOH-,PH=7.0,十一、举例：某产品的干扰试验,3.内毒素标准品溶液的制备细菌内毒素标准品溶液和内毒素供试品溶液的制备：分别用鲎试剂和供试品溶液将同一支内毒素标准品按以下步骤稀释： 0.2ml 0.2ml 1.0ml,150EU/ml 15EU/ml 1.5EU/ml 0.5EU/ml,1.8ml,1.8ml,2.
17、0ml,1.0ml,1.0ml,1.0ml,1.0ml,0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml,1.0ml,1.0ml,十一、举例：某产品的干扰试验,4.反应结果,十一、举例：某产品的干扰试验,5.结果分析试验有效性判断： NC管必须全部为阴性 NPC管必须全部为阴性 TAL与内毒素水溶液系列： 2管均为阳性(+)，0.25管均为阴性(- - - - ) 试验结果符合以上条件，试验有效。,十一、举例：某产品的干扰试验,按下式计算系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et) Es=antilg(Xs4) =antilg(lg0.25Euml4)4=0.25Eu
18、ml Et=antilg (Xt4) =antilg(lg0.25Euml3+lg0.5Euml)4=0.297Euml0.5Es2且0.5EsEt2Es ，供试品在0.5mgml浓度下无干扰作用。,十二、消除干扰的方法,供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。 1.供试品稀释法 MVD=CL / 鲎试剂灵敏度()越高(数值越小)，供试品的稀释倍数越大，干扰越小。,十二、消除干扰的方法,2.物理方法 如加热法(血液制品)、冷析法(甘露醇 ) 3.化学方法 如调节PH值(奎诺酮类)、调节金属离子(血液保养液、FDP
19、) 4.生物方法 如抗增液的使用，阻断G因子反应，防止假阳性； 5.其它方法 如过滤法、溶剂抽提等,十三、检品的日常检查,1.经过干扰试验的验证后，则可进行检品的日常内毒素检查，检查法的反应管按以下设置： 注：A为供试品溶液；B供试品阳性对照(PPC)；C为阳性对照(PC)；D为阴性对照(NC),十三、检品的日常检查,2.加样反应,十三、检品的日常检查,3.结果判断,十四、注意事项,防止鲎试验用水被污染开启内毒素标准品和鲎试剂时，要将粘附在安瓿壁上的粉末尽可能地弹落下去。用砂轮划过安瓿后，要用酒精棉（最好能用沾异丙醇的无纺布，以避免产生假阳性结果）擦拭，防止开启时玻璃屑落入安瓿内。开启内毒素标
20、准品时，要在安瓿曲颈上部，并尽可能保留较长的安瓿颈，准确加入1.0ml鲎试验用水复溶。,十四、注意事项,细菌内毒素要充分混合均匀1.内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器混合15分钟，以后的每一步稀释前要至少混合30秒，其它国家药典也有类似要求；2.具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布。3.不按要求进行旋涡混合器混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确的实验结果。,十四、注意事项,对灵敏度标示值的误解：如=0.06EU/ml，实际上表示的灵敏度=0.0625EU/ml，这样写是为了简便。稀释过程中一定要按照=0.0625EU/ml来稀释，否则，会对实验结果有影响。凡含内毒素标准品的溶液在加样前须再漩涡混合至少30秒钟。在保温过程中要注意不要振动，以免因振动造成假阴性结果。,
