1、 毕 业 论 文（设计） 题 目 动物源性食品中磺胺类药物的检测 指导老师 张波 专业班级 食品营养与检测 122 姓 名 张佳丽 学 号 20127100216 2015 年 5 月 28 日浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） I 摘要： 采用超高效液相色谱 -串联质谱技术测定 猪肉和奶粉 中十六种磺胺类药物的残留。样品经 乙腈提取， 提取液旋发浓缩至近干 ， 残 渣用 1mL 流动相定容，经正己烷脱脂后过膜 ，通过 Waters C18 色谱柱分离，以 乙腈和 0.1%（体积分数）的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾 -正离子多反应监测的质谱模式，以基质外标法进行定量分析。实验结
2、果表明， 16 种磺胺类药物在 1-200 g/L 的 浓度范围内线性相关系数均大于 0.99，该方 法的定量限为 3.0 5.0g/kg，在 3 个浓度添加水平下，各种磺胺类药物的总体回收率为 80.2% 130.1%，相对标准偏差 均 小于 7.6%。该 检测 方法操作简单快速、回收率和灵敏度高、重现性好、检出限低，满足动物源性食品中十六种磺胺类药物的检测要求。 关键词： 超高效液相色谱 -串联质谱；磺胺类药物残留；动物源性食 品 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） II 目 录 引言 . 1 1 材料与仪器 . 2 1.1 实验材料 . 2 1.2 实验试剂 . 2 1.3 实验仪器
3、. 2 2 实验 方法 . 3 2.2 实验条件 . 3 2.2.1 色谱条件 . 3 2.2.2 质谱条件 . 3 3 结果与 分析 . 4 3.1 色谱条件的优化 . 4 3.2 质谱条件的优化 . 5 3.3 线性范围 . 5 3.4 回收率和精密度 . 6 3.5 检出限和定量限 . 8 3.6 实际样品测试 . 8 结论 . 9 参考文献 . 10 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 1 页 引言 磺胺类药物是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物 1。也是应用最早的一类人工合成抗菌药物 , 具有抗菌谱广、疗效强、方便安全等优点
4、 , 广泛应用于畜牧业生产、禽类饲养以及渔业养殖。该药物在动物体内的作用和代谢时间较长，人类摄入含磺胺类药物残留的动物性食品，可能对健康造成潜在的危害 ,可引起人体过敏反应、泌尿系统受损、血液系统的不良反应及机体产生抗药性等。近年来，由于人们不合理使用和滥用磺胺类药物以及不遵守休药期等，问题不断显现出来。 2007 年 12 月日本产牛肉 被检出磺胺间甲氧嘧啶钠含量严重超标， 2008 年 10 月广东对蔬菜畜禽质量抽检，鸡肉磺胺类药物残留超标， 2013 年 5 月明一婴儿奶粉检出磺胺多辛等。目前，中国、欧盟、美国、日本等均将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物 , 其最大残余限量一般
5、为 50 100g/kg，其中日本对磺胺二甲嘧啶的最大残余限量要求小于 10g/kg 2。因此，对动物源性食品中磺胺类药物残留的检测的研究具有重要的现实意义。 磺胺类药物残留检测的方法主要有酶联免疫法、液相色谱法和液相色谱 -串联质谱法。近年来，国内外有关于测定动物源性 食品中磺胺类药物的方法报道有较多。冯才伟等建立酶联免疫法对猪肉中的磺胺药物残留的检测，最低检测限为1.5g/kg，平均回收率范围为 76.1% 101.7%3。查玉兵等建立高效液相色谱法测定猪肉中猪肉中五种磺胺类药物残留的测定，最低检出限为 5g/kg,样品的加标回收率为 80.1% 96.5%4。虽然，酶联免疫法具有操作简单
6、、快速的优点，但容易产生交叉反应和假阳性，检测结果较不准确。液相色谱法具有分离速度快、分析效率高等优点，但由于基质干扰的存在难于准确定性和定量分析 5-6。因此迫切需要建立一种 快速、准确、高效的检验方法。超高效液相色谱 -串联质谱技术可同时测定多个目标化合物，超高效液相色谱的高分离效能与质谱的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息相结合成为强有力的分析工具，以其操作简便准确度和灵敏度高、选择性强等优点成为兽药抗生素残留检测的筛查方法 7。随着对UPLC-MS/MS 的深入研究和该技术应用的普及， UPLC-MS/MS 已经成为药物分析的有利工具。 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 2 页
7、 本文以猪肉和奶粉为检测对象利用超高效液相串联质谱技术建立动物源性食品中十六种磺胺类药物的定性和定量一次进样完成检测的方法。该方法具有高效、快速、 检出限低、灵敏度高的特点。 1 材料 与仪器 1.1 实验材料 猪肉，奶粉 (实验室提供 ) 1.2 实验试剂 甲醇、乙腈：色谱纯，德国 Merck 公司产品；甲酸：色谱纯，美国 TEDIA 公司产品；水为 Milli-Q 系统纯水化。 磺胺醋酰（纯度 99.5%），磺胺嘧啶（纯度 99.5%），磺胺噻唑（纯度99.5%），磺胺吡啶（纯度 99.0%），磺胺甲基嘧啶（纯度 99.2%），磺胺二甲嘧啶（纯度 99.0%），磺胺对甲氧嘧啶（纯度 98.
8、0%），磺胺甲噻二唑（纯度 99.0%）， 磺胺甲氧哒嗪 （纯度 99.2%） ， 磺胺 -6-甲氧嘧啶 （纯度 99.0%） ，磺胺氯哒嗪 （纯度 99.0%） ，磺胺邻二甲氧嘧啶 （纯度 99.5%） ，磺胺甲氧异恶唑 （纯度 99.0%） ，磺胺二甲异恶唑 （纯度 98.0%）， 磺胺间二甲氧嘧啶 （纯度 99.5%） ，磺胺苯吡唑 （纯度 99.0%），标准品均购于 德国 Dr.E 公司 。 标准溶液的配制：分别准确称取 10.0mg 上述标准品（需折算标准品纯度）于10mL 容量瓶中，用甲醇定容，配制成 1.0mg/mL 的储备液，密封储存于 -18 冰箱中。分别吸取 50L 的 1
9、.0mg/mL 的标准溶液 于 10mL 容量瓶，用甲 醇定容，配制成 5.0g/mL的混合标准溶液， 用时再 稀释成一系列浓度的标准溶液，待测。 1.3 实验仪器 AcquityTM超高效液相色谱仪和 XevoTMTQ-MS质谱仪，美国 Waters公司产品，配有电喷雾电离接口 （ ESI)及 Masslynx数据处理系统； Milli-Q超纯水器，美国 Millipore公司产品； 旋转蒸发仪 ， B-740，瑞士 BUCHI 公司 ； 高速离心机， ST16R， 美国 Thermo 公司 ； 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 3 页 涡旋混合仪， WH-861，太仓市华利达实验设
10、备有限公司。 2 实验方法 2.1 样品处理 称取 5g 试样， 精确至 0.01g，置于 50mL 离心管中加入 20g 无水硫酸钠和 20mL乙腈，均质 2min 后以 8000 r/min 超速离心 3 min。上清液倒入 100mL 鸡心瓶中，残渣再加入 20mL 乙腈，重复上述操作一次。 合并 上清液后 ，向鸡心瓶中加入 10mL异丙醇，用旋转蒸发器于 50 水浴蒸干，准确加入 1mL 流动相和 1mL 正己烷溶解残渣。转移至 5mL 离心管中，涡旋 1min,以 3000r/min 离心 3min,将 上层正己烷弃去，再加入 1mL 正己烷，重复上述步骤，直至下层水相变成透明液体。
11、按上述操作步骤制备样品空白提取液。取下层清液 ，过 0.22m滤膜后，用 超高效 液相色谱 -串联质谱仪测定。 2.2 实验条件 2.2.1 色谱条件 色谱柱： Waters Acquity UPLC BEH C18 柱 2.1mm100mm,粒径 1.7m；柱温：35 ；样品温度： 25 ；进样体积： 5L；流速： 0.2mL/min;流动相：乙腈 (A),0.1%甲酸水溶液 (B)； 按 表 2.1 洗脱程序进行梯度洗脱 。 表 2.1 梯度洗脱程序 时间 (min) A： 乙腈 (%) B： 0.1%甲 酸 水 (%) 0 5 5 9 9 13 13 15 15 16 16 17 17
12、20 10 10 40 40 40 90 90 90 10 10 90 90 60 60 60 10 10 10 90 90 2.2.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源 (ESI)；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 4 页 测 （ MRM)；毛细管电压为 2.80kV，离子源温度为 150 ，脱溶剂气温度为 500 ，脱溶剂气流流量为 1000L/h。 3 结果 与分析 3.1 色谱条件的优化 高效的色谱柱是多组分分析的前提条件，本实验用 Waters Acquity UPLC BEH C18 柱 （ 2.1mm100mm,粒径 1.7m）色谱柱
13、来分离十六种磺胺类药物，如图3.1，此色谱柱对各化合物具有较强的保留，各色谱峰峰型较好，并得到了有效的分离，减少了杂质的干扰。 分别选择甲醇和乙腈作为强洗脱流动性。实验证明：当甲醇作为流动相时，离子化受到不同程度的抑制，峰型变宽，峰度明显降低，导致灵敏度下降，而乙腈的离子化效率明显优于甲醇，故本实验采用乙腈强洗脱流动性。在流动相中加入甲酸能增加各种化合物在 ESI 模式下的离子化效率，改善各化合物的峰形。本实验分别配制 0.05%， 0.1%和 0.2%的甲酸水溶液作为流动相，经试验表明 0.1%的甲酸水溶液体系能提供最佳离子化条件，峰面积信号最强，灵敏度最高。 图 3.1 十六种磺胺类药物的
14、 MRM 色谱图 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 5 页 3.2 质谱条件的优化 在电喷雾质谱、正离子监测模式下，分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量和选择离子等进行充分的优化，选取经碰撞后所得峰度较高的两个子离子作为定量和定性离子，并确定其最佳碰撞能量的电压值。最终所选择确定的母离子、子离子和碰撞能量等参数见表 3.1。 表 3.1 十六种磺胺类药物的质谱分析条件 编号 化合物 保留时间 (Min) 监测离子 (m/z) 锥孔电压 (V) 碰撞能量(eV) 1 磺胺醋酰 3.14 215.00/155.95*,215.00/107.90 20 10,20 2 磺胺嘧啶 4.27 2
15、51.10/156.00*,251.10/107.90 20 16,22 3 磺胺噻唑 5.88 256.10/156.00*,256.010/107.90 26 15,24 4 磺胺吡啶 6.48 250.10/156.00*,250.10/184.10 25 16,18 5 磺胺甲基嘧啶 7.50 265.10/156.00*,265.10/172.00 25 20,16 6 磺胺二甲嘧啶 10.52 279.10/186.00*,279.10/156.00 28 17,20 7 磺胺对甲氧嘧啶 10.76 281.10/156.00*,281.10/215.15 28 18,22 8 磺
16、胺甲噻二唑 11.00 271.00/156.00*,271.00/107.90 22 14,24 9 磺胺甲氧哒嗪 11.52 281.10/156.00*,281.10/215.15 28 18,22 10 磺胺 -6-甲氧嘧啶 12.06 281.10/156.00*,281.10/215.15 28 18,22 11 磺胺氯哒嗪 12.41 285.00/156.00*,285.00/107.95 22 15,24 12 磺胺邻二甲氧嘧啶 12.53 311.10/156.00*,311.10/107.90 30 20,28 13 磺胺甲氧异恶唑 12.85 254.10/156.00
17、*,254.10/107.90 25 16,24 14 磺胺二甲异恶唑 13.08 268.00/155.80*,268.00/112.80 23 14,18 15 磺胺间二甲氧嘧啶 14.19 311.10/156.00*,311.10/107.90 30 20,28 16 磺胺苯吡唑 14.86 315.10/156.00*,315.10/160.10 34 20,24 *定量离子 3.3 线性范围 配制系列标准溶液，磺胺类化合物浓度分别为 1， 10， 25， 100， 150， 200g/L，浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 6 页 以各分析物的峰面积 （ y） 为纵坐标，质量
18、浓度 （ x） 为横坐标绘制标准曲线，线性回归方程及相关系数见表 3.2。结果表明：各种磺胺类药物在各自的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数 r 均在 0.99 以上。 表 3.2 十六种磺胺类药物的线性方程、线性范围、相关系数 编号 化合物 线性范围 (g/L) 线性方程 相关系数 (r2) 1 磺胺醋酰 1-200 Y=816.703x-15.4365 0.9919 2 磺胺嘧啶 1-200 Y=1026.89x-539.694 0.9972 3 磺胺噻唑 1-200 Y=2432.05x-485.044 0.9969 4 磺胺吡啶 1-200 Y=4932.29x-875.165 0.
19、9999 5 磺胺甲基嘧啶 1-200 Y=1144.3x-506.464 0.9984 6 磺胺二甲嘧啶 1-200 Y=2813.65x-707.355 0.9973 7 磺胺对甲氧嘧啶 1-200 Y=8139.30x-132.487 0.9937 8 磺胺甲噻二唑 1-200 Y=7650.94x-111.703 0.9952 9 磺胺甲氧哒嗪 1-200 Y=3292.1x-657.229 0.9995 10 磺胺 -6-甲氧嘧啶 1-200 Y=2508.70x-104.386 0.9908 11 磺胺氯哒嗪 1-200 Y=2877.12x-357.765 0.9967 12 磺
20、胺邻二甲氧嘧啶 1-200 Y=2553.65x-433.924 0.9968 13 磺胺甲氧异恶唑 1-200 Y=602.044x-70.6146 0.9905 14 磺胺二甲异恶唑 1-200 Y=3095.18x-716.885 0.9954 15 磺胺间二甲氧嘧啶 1-200 Y=2538.16x-578.472 0.9968 16 磺胺苯吡唑 1-200 Y=1541.36x-376.231 0.9957 3.4 回收率和精密 度 分别在阴性的猪肉、奶粉样品基质中添加低、中、高三个不同浓度水平的混合标准溶液，每个浓度做三个平行，根据不同基质的性质，按 2.1 方法进行预处理，回收率
21、 和相对标准偏差 见表 3.3 和 3.4。 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 7 页 表 3.3 磺胺类药物的回收率（猪肉基质加标） 编号 化合物 猪肉加标 (g/kg) 3.0 15.0 80 回收率 % RSD% 回收率 % RSD% 回收率 % RSD% 1 磺胺醋酰 89.4 1.2 113.7 2.6 82.5 2.0 2 磺胺嘧啶 114.8 0.9 117.1 0.5 107.4 1.2 3 磺胺噻唑 100.3 2.0 116.8 1.7 107.3 1.9 4 磺胺吡啶 99.7 2.4 114.2 2.7 108.1 2.4 5 磺胺甲基嘧啶 100.7 1.8
22、115.3 2.0 106.4 2.4 6 磺胺二甲嘧啶 103.8 2.9 118.3 1.6 112.4 1.8 7 磺胺对甲氧嘧啶 100.5 3.0 130.1 2.7 95.4 2.6 8 磺胺甲噻二唑 116.2 3.6 126.6 4.0 118.7 4.2 9 磺胺甲氧哒嗪 108.7 4.6 130.1 5.2 90.0 5.2 10 磺胺 -6-甲氧嘧啶 94.1 3.7 125.0 4.1 87.6 4.7 11 磺胺氯哒嗪 90.4 5.5 102.8 4.8 95.0 5.8 12 磺胺邻二甲氧嘧啶 91.2 2.8 121.5 3.7 115.6 3.0 13 磺胺
23、甲氧异恶唑 103.4 3.8 125.3 4.0 115.4 6.2 14 磺胺二甲异恶唑 126.0 4.1 114.5 3.9 109.1 5.8 15 磺胺间二甲氧嘧啶 93.4 5.0 104.9 5.5 97.8 4.5 16 磺胺苯吡唑 99.8 4.8 114.6 5.0 101.9 6.3 表 3.4 磺胺类药物的回收率（奶粉基质加标） 编号 化合物 奶粉加标 (g/kg) 5 25 125 回收率 % RSD% 回收率 % RSD% 回收率 % RSD% 1 磺胺醋酰 99.7 4.0 103.5 3.6 104.6 4.1 2 磺胺嘧啶 87.6 2.8 86.4 2.6 84.4 3.5 3 磺胺噻唑 80.2 3.8 90.3 4.5 90.4 4.0 4 磺胺吡啶 87.7 3.9 85.6 3.8 84.0 4.6 5 磺胺甲基嘧啶 91.7 5.0 92.3 5.1 93.0 5.6
