1、 毕 业 论 文（设计） 题 目 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 指导老师 张波 专业班级 食品营养与检测 122 姓 名 薛雨霖 学 号 20127100213 2015 年 5 月 28 日 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） I 摘要 ： 蛋白酶在一定的温度和 pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂 （ Folin） 还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在 660nm测定其吸光度，计算出蛋白酶活力。本实验确定了样品的提取液为蒸馏水、底物酪蛋白用量为 1mL、样品的稀释倍数（酸性蛋白酶为 1500-250
2、0，中性蛋白酶为 500-2000），并对样品中酸性和中性蛋白酶活力的稳定性进行测定，测得的稳定性较高。本方法测得的两种样品的标准偏差均小于 10%，因此该方法具有良好的精密度。 关键词： 饲料添加剂；酸性和中性蛋白酶；酶活力 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） II 目 录 引言 . 1 1 材料和仪器 . 1 1.1 原料 . 1 1.2 仪器设备 . 1 1.3 主要试剂 . 1 2 实验方法 . 2 2.1 主要试剂的配制 . 2 2.1.1 1mol/L 及 0.1mol/L 的盐酸溶液的配制 . 2 2.1.2 0.4mol/L 的碳酸钠溶液的配制 . 2 2.1.3 福林试剂的
3、配制 . 2 2.1.4 pH3.5 乳酸缓冲液的配制 . 2 2.1.5 pH7.0 的磷酸缓冲液的配制 . 2 2.1.6 1.0%酪蛋白溶液的配制 . 2 2.1.7 0.4mol/L 的三氯乙酸溶液的配制 . 3 2.1.8 L-酪氨酸标准溶液的配制 . 3 2.2 样品酶液的制 备 . 3 2.3 酸性和中性蛋白酶活力的测定方法 . 3 2.4 计算 . 4 3 结果与 分析 . 4 3.1 标准曲线绘制 . 4 3.2 实验条件对饲料蛋白酶活力的影响 . 5 3.2.1 样品提取液对酸性蛋白酶活力的影响 . 5 3.2.2 底物酪蛋白用量对酸性和中性蛋白酶活力的影响 . 6 3.2
4、.3 不同稀释倍数的样品酶液对酸性和中性蛋白酶活力的影响 . 6 3.2.4 对酸性和中性蛋白酶活力稳定性的测定 . 7 结论 . 7 参考文献 . 8 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 1 页 引言 蛋白酶是饲料工业中比较常见的一种饲用酶，蛋白酶是可以使蛋白质水解成-氨基酸的酶，蛋白酶分为酸性酶、碱性酶、中性酶，酸性酶适宜 pH 值为 2-5，产生该酶的微生物主要有黑曲霉、根霉、米曲霉；中性蛋白酶的最适宜 pH 值为7 左右，活力值最高时约在 4-50 ， 主要由霉菌和细菌产生，其测定分析方法主要有福林显色法、紫外光谱法。因其 紫外分光光度测定法的检出限和定量限都显著低于福林酚法测定
5、法 ， 本文使用福林显色法测定两种酶的活性，其原理是蛋白酶在一定的温度和 pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂（ Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在 660nm 测定其吸光度，计算出蛋白酶活力。本实验采用福林显色法对饲料蛋白酶活力进行测定，摸索 福林酚法测定 蛋白酶 的条件。 并对反应条件进行优化，以提高测定的准确性。 1 材料和仪器 1.1 原料 含酸性蛋白酶的饲料 ,含中性蛋白酶的饲料。 1.2 仪器设备 Lambda-20 型紫外可见分光光度计 (美国 Pekin-Elmer 公司 )、 Sa
6、rtorious BS 223S 型电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司 )、 HHS-4 型电热恒温水浴锅、精密 pH 计、秒表等。 1.3 主要试剂 1mol/L及 0.1mol/L的盐酸溶液、 0.4mol/L的碳酸钠溶液、福林试剂、 pH3.5的乳酸缓冲液、 pH7.0的磷酸缓冲液、 1.0 的酪素溶液（干酪素由杭州微生物试剂有限公司生产）、 0.4mol/L的三氯乙酸溶液 、 100g/mL L-酪氨酸标准溶液。 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 2 页 2 实验方法 2.1 主要试剂的配制 2.1.1 1mol/L及 0.1mol/L的盐酸溶液的配制 取浓盐酸 85mL
7、,加水稀释并定容至 1000mL，即为 1mol/L 盐酸溶液；取100mL1mol/L 盐酸溶液，定容至 1000mL，即为 0.1mol/L 盐酸溶液。 2.1.2 0.4mol/L的碳酸钠溶液的配制 称取无水碳酸钠 42.4g，用水溶解并定容至 1000mL。 2.1.3 福林试剂的配制 于 1000mL 磨口回流装置中加入钨酸钠 （ NaWO4.2H2O） 100g、钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)25g、水 700mL、 85%磷酸 50mL、浓盐酸 100mL。小火沸腾回流 10h，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂 （ Li2SO4） 50g，加水 50mL 和数滴浓溴水（
8、99%），再微沸 15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却后加水定容至 1000mL。混匀过滤。试剂应 呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以 1 份福林试剂与 2 份水混匀，制成稀福林试剂。 2.1.4 pH3.5 乳酸缓冲液的配制 甲液：称取 80%-90%乳酸 10.6g,加水稀释并定容至 1000mL。 乙液：称取 70%乳酸钠 16g，加水稀释并定容至 1000mL。 使用溶液：取甲液 2 份，加乙液 1 份，再准确稀释 1 倍。用 pH 计调整 pH至 3.5,备用。 2.1.5 pH7.0 的磷酸缓冲液的配制 甲液：称取磷酸氢二钠（ Na2H
9、PO4.12H2O） 71.64g，用水溶解，并定容至 100mL。 乙液：称取磷酸二氢钠（ NaH2PO4.2H2O） 31.21g，用水溶解，并定容至 1000mL。 使用溶液：取甲液 610mL，加乙液 390mL 混匀，用 pH计调整 pH至（ 7.00.05），备用。 2.1.6 1.0%酪蛋白溶液的配制 精确称取酪蛋白 1.0000g，先用少量浓乳酸湿润后，再加入乳酸缓冲液使用溶液约 80mL（若测定中性蛋白酶，则先用少量 0.5mol/L 氢氧化钠溶液湿润后，浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 3 页 再加磷酸缓冲液使用溶液约 80mL）。在沸水浴中边加热边搅拌直至完全溶解
10、。冷却后转入 100mL 容量瓶中，用相应缓冲溶液定容至刻度。此容液在 4 冰箱贮存，有效期为 3 天。 2.1.7 0.4mol/L的三氯乙酸溶液的配制 称取三氯乙酸 65.4g,用水溶解，并定容至 1000mL。 2.1.8 L-酪氨酸标准溶液的配制 精确称取预先于 105 干燥至恒重的 L-酪氨酸标准物质 0.1000g，用 20mL mol/L 盐酸溶解后，再用蒸馏水定容至 100mL，即为 1mg/mL 酪氨酸标准储备溶液。吸取 1mg/mL 酪氨酸标准储备溶液 10.0mL 用 0.1mol/L 盐酸定容至 100mL，即得到 100ug/mL L酪氨酸标准溶液。 2.2 样品酶液
11、的制备 含酸性蛋白酶的添加剂饲料：称取 2g 样品，精致 0.01g，于 100mL 容量瓶中，加入 90mL 蒸馏水或乳酸缓冲液，摇匀后置 40 水浴浸提 30min，取出冷却后定容至 100mL，过滤。滤液根据酶活性大小，用乳酸缓冲液使用溶液稀释至适宜浓度。 含中性蛋白酶的添加剂饲料：称取 2g 样品，精致 0.01g，于 100mL 容量瓶中，加入 90mL 蒸馏水或磷酸缓冲液，摇匀后置 40 水浴浸提 30min，取出冷却后定容至 100mL，过滤。滤液根据酶活性大小，用乳酸缓冲液使用溶液稀释至适宜浓度。 2.3 酸性和中性蛋白酶活力的测定方法 取三支 15150mm试管（一支空白管，
12、二支样品管），分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液 1.0mL，将试管放入（ 400.2） 水浴中预热 5min，向二支样品管中再加入一定量的经同样预热的 1%酪素溶液，准确计时，反应 10min，取 出。迅速、准确向三支试管中加入 0.4mol/L 三氯乙酸溶液 2mL，于空白管中加入与样品管一样量的 1%酪素溶液，摇匀。将三支试管继续置（ 400.2） 水浴中放置 10min，取出迅速冷却至室温。将三支试管中的反应液离心或过滤。另取三支 18180mm 的试管（一支空白管，二支样品管）分别吸取上述相应的滤浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 4 页 出液 1.0mL， 0.4mol
13、/L 碳酸钠溶液 5.0mL，稀福林试剂 1.0mL,摇匀，置（ 400.2）水浴中放置 20min，取出，迅速冷却至室温。以空白管（对照）调仪器零点，在风光光度计波长 660nm 下，用 10mm 比色杯，分别测二支样品管中样液的吸光度，取平均值。 2.4 计算 按照下式计算样品中酸性和中性蛋白酶的活力： X1 = 101 W NZVKA .公式 （ 2.1）X1 蛋白酶活力， U/g（ U/mL） A 样品与空白的吸光度差 K 比色常数 V 样品提取时加入水的量（ mL） Z 酶反应体系总体积（ mL） N 样品二次稀释时的稀释倍数 1 参与反应的酶量 (mL) W 样品重量（ g 或 m
14、L） 10 反应时间 3 结果与 分析 3.1 标准曲线绘制 分别吸取 100g/mL L酪氨酸标准溶液 0mL、 1.0mL、 2.0mL、 3.0mL、 4.0mL、5.0mL、 6.0mL 于 10mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。分别吸取 L-酪氨酸标准使用溶液 1.0mL，加碳酸钠溶液 5.0mL 和稀福林试剂 1.0mL，于标准管中，混匀，见表 3.1。将标准管同时置于 40 水浴，反应 20min，取出，迅速冷却至室温，以空白管调仪器零点，在分光光度计波长 660nm处测吸光度。以吸光度为横坐标，以酪氨酸量为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程 ,见图3.1。当吸光度为
15、 1 时得酪氨酸量（ g）即为比色常数 K 值， K 97.5539。新配制的福林试剂制作新的标准曲线。 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 5 页 表 3.1 标准曲线数据 L 酪氨酸标准溶液体积 （ mL） 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 L 酪氨酸标准溶液浓度 （ ug/mL） 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 吸光度值 0.000 0.096 0.200 0.315 0.415 0.507 0.612 图 3.1 标准曲线图 3.2 实验条件对饲料蛋白酶活力的影响 3.2.1 样品提取液对酸性蛋白酶活力的影响 称取 2g含
16、酸性蛋白酶的饲料 2份（每份做三个平行样），一份加蒸馏水提取，另一份加 pH3.5 的乳酸缓冲液提取，两种不同的提取液对酸性蛋白酶活力的影响见表 3.2。 表 3.2 两种不同提取液对酸性蛋白酶活力的影响 项 目 蒸馏水 pH3.5 的乳酸缓冲液 7418 7486 7223 7626 7325 7511 酸性蛋白酶活力 （ U/mL） 7322 7541 注：此结果为三次测得的平均值。 从表 3.2 可知，用蒸馏水与乳酸缓冲液提取样品测得的酸性蛋白酶活力无明显差别，故下面实验均采用蒸馏水作样品的提取液。 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计） 第 6 页 3.2.2 底物酪蛋白用量对酸性和中性
17、蛋白酶活力的影响 将 1mL的样品稀释液与 1mL、 2mL底物酪蛋白分别反应，实验结果见表 3.3。 表 3.3 底物酪蛋白用量对酸性和中性蛋白酶活力的影响 项目 底物酪蛋白 （ mL） 1 2 酸性蛋白酶活力 （ U/mL） 7671 7894 中性蛋白酶活力 （ U/mL） 7907 7550 由表 3.3 可知，酪蛋白用量从 1mL 增加到 2mL，酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力都没有明显的变化，说明底物用量为 1mL 时酶与底物酪蛋白的结合已经饱和，因此底物酪蛋白用量都仍然采用 1mL。 3.2.3 不同稀释倍数的样品酶液对酸性和中性蛋白酶活力的影响 不同稀释倍数的样品酶液对酸性和中
18、性蛋白酶活力的影响，见表 3.4 和表3.5. 表 3.4 不同稀释倍数对酸性蛋白酶活力的影响 稀释倍数 样品吸光度 A1 空白吸光度 A2 吸光度差（ A1-A2） 酸性蛋白酶活力（ U/mL） 1000 0.409 0.076 0.353 6494 1500 0.329 0.061 0.268 7839 2000 0.265 0.059 0.206 8034 2500 0.211 0.043 0.168 8190 由表 3.4 可知吸光度差在 0.15-0.3 之间酸性蛋白酶活力较稳定，本样品可选择稀释倍数在 1500-2500 范围之内。本实验选择稀释倍数为 2000，对酸性蛋白酶活力进
19、行测定。 表 3.5 不同稀释倍数对中性蛋白酶活力的影响 稀释倍数 样品吸光度 A1 空白吸光度 A2 吸光度差（ A1-A2） 中性蛋白酶活力（ U/mL） 500 0.452 0.072 0.380 7385 1000 0.234 0.035 0.199 7734 1500 0.151 0.023 0.128 7462 2000 0.120 0.019 0.101 7851 由表 3.5 可知样品吸光度差在 0.1-0.4 之间中性蛋白酶活力较稳定，本样品可选择稀释倍数在 500-2000 范围之内。本实验选择稀释倍数为 1000， 对中性蛋白酶活力进行测定。 浙江经贸职业技术学院毕业论文
20、（设计） 第 7 页 3.2.4 对酸性和中性蛋白酶活力稳定性的测定 称取样品酸性蛋白酶饲料 2g 稀释 2000 倍，中性蛋白酶饲料 1g 稀释 1000倍，分别吸取稀释液与 1mL1%的 酪蛋白反应，分别做 6 个 平行样，对酸性和中性蛋白酶活力进行稳定性测定 ,见表 3.6。由表 3.6 可知，酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力都具有较高的稳定性。 表 3.6 酸性和中性蛋白酶活力稳定性 样品 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD(%) 酸性蛋白酶活力（ U/mL） 7801 7625 8100 8045 7945 8065 7930 2.3 中性蛋白酶活力（ U/mL） 6633 6653 6465 6458 6594 6407 6535 1.6 结论 本文采用福林显色法对饲料添加剂酸性和中性蛋白酶活力进行测定，实验中进一步确定了样品的提取液为蒸馏水、底物酪蛋白用量为 1mL 和样品的稀释倍数（酸性蛋白酶为 1500-2500，中性蛋白酶为 500-2000），并对样品中酸性和中性蛋白酶活力的稳定性进行测定。本方法测得的两种样品的标准偏差均小于 10%，因此该方法具有良好的精密度。
