1、 西华大学毕业论文 毕 业 论 文 题 目 :有机白萝卜表皮附生乳酸菌链霉素抗性分析 学院 (直属系 ): 食品与 生物工程学院 年级、专业 : 2011 生物工程 学 生 姓 名 : 学 号 : 312011081801301 指 导 教 师 : 完 成 时 间 : 2015 年 5 月 20 日 西华大学毕业论文 目 录 摘 要 . 1 Abstract. 2 1 前言 . 3 1.1 抗生素的定义 . 3 1.2 抗生素的用途简介 . 3 1.3 萝卜表皮附生乳酸菌 . 3 1.4 链霉素 . 4 1.5 16S rRNA 分析技术在乳酸菌分类学的应用 . 4 1.6 本论文研究的目的及
2、意义 . 5 2 材料和方法 . 5 2.1 材料和仪器 . 5 2.1.1 样品 . 5 2.1.2 试剂 . 6 2.1.3 仪器 . 7 2.1.4 培养基及配制 . 7 2.2 实验方法 . 8 2.2.1 乳酸菌的培养 . 8 2.2.2 乳酸菌的分离纯化 . 8 2.2.3 乳酸菌总 DNA 的提取 . 9 2.2.4 16S rRNA 目的基因的 PCR 扩增及克隆分析 . 9 2.2.5 最小抑制浓度（ MIC）的测定 . 12 3 结果 . 12 3.1 乳酸菌的分离 . 12 3.2 基因组 DNA 的提取 . 13 3.3 16S rRNA 的 PCR 扩增片断电泳结果分
3、析 . 13 3.4 重组子的筛选和鉴定 . 14 3.5 16S rRNA 分析 . 16 3.6 链霉素抗性分析结果 . 17 4 结论 . 19 总结与体会 . 20 致谢词 . 21 参考文献 . 221 西华大学毕业论文 摘 要 以市售的有机白萝卜为研究对象，分析其表皮附生的乳酸菌对链霉素的抗药性。分离菌株的 16S rRNA 和抗药性分析表明： 从有机白萝卜表皮分离得到的 43株菌分别属于 Pediococcus pentosaceus（ 44%）、 Leuconostoc mesenteroides（ 16%）、Leuconostoc pseudomesenteroides（ 5
4、%）、 Leuconostoc citreum（ 16%）、 Leuconostoc holzapfelii（ 14%） 和 Weissella cibaria（ 5%）。 在分离得到的 43 株乳酸菌中，共有 8 菌株表现出了对链霉素的抗药性，占所有乳酸菌的 18.6%；其中，在 19 株P. pentosaceus 中，有 5 株菌表现出对链霉素的抗药性； L. mesenteroides 和 L. pseudomesenteroides对链霉素都表现为敏感； L. citreum、 L. holzapfelii和 W. cibaria分别有一株菌表现出对链霉素的抗药性。 【关键词】 有机
5、白萝卜；乳酸菌；链霉素；抗药性 2 西华大学毕业论文 Abstract The epibiotic lactic acid bacteria (LAB) on the surface of organic radish were investigated by MRS culture, 16S rRNA and antibiotic resistance. 43 isolates in current study were assigned to Pediococcus pentosaceus (44%), Leuconostoc mesenteroides (16%), Leuconosto
6、c pseudomesenteroides (5%), Leuconostoc citreum (16%), Leuconostoc holzapfelii (14%) and Weissella cibaria (5%). And 8 (18.6%) isolates displayed the resistance of streptomycin. Among the Pediococcus pentosaceus, there were 5 isolates resistances of streptomycin. For Leuconostoc mesenteroides and Le
7、uconostoc pseudomesenteroides, all of them were sensitive to streptomycin. In the Leuconostoc citreum, only one isolate displayed the resistance of streptomycin; Regarding the Leuconostoc holzapfelii, 1 isolate was resistance; For the Weissella cibaria, 1 isolate was resistance. Keywords: Organic wh
8、ite radish; Lactobacillus; streptomycin; resistance 3 西华大学毕业论文 1 前言 白萝卜是根菜类的主要蔬菜，属十字花科、萝 卜属的一年或二年生草本双子叶植物 1。在我国白萝卜栽培历史悠久，是一种药食同源的大众化蔬菜，富含维生素 C、芥子油、淀粉酶和粗纤维，具有促进消化，增强食欲，加快胃肠蠕动和止咳化痰的作用，可以治疗或辅助治疗多种疾病，为食疗佳品，被本草纲目称之为 “蔬中最有利者 ”，因此常被作为水果而鲜食 1。乳酸菌是蔬菜表面常见的附生微生物，长期以来被普遍认为是安全 2。然而，近年来越来越多抗生素抗药性乳酸菌被发现具有一定可转移的抗药性
9、，为乳酸菌的安全敲响了警钟。 1.1 抗生素的定义 抗生素（ antibiotics）是由 微生物 （包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌 3 培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的 化合物 。目前已知天然抗生素不下万种。 1.2 抗生素的用途简介 抗生素以前被称为 抗菌素 ，事实上它不仅能杀灭 细菌 而且对 霉菌 、 支原体 、衣原体 、 螺旋体 、 立克次氏体 等其它致病 微生物 也有良好的抑制和杀灭作用，通常将抗菌素改称为 抗生素。抗生素可以是某些微
10、生物生长繁殖过程中产生的一种物质，用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或部分人工合成的。通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种非病毒感染的药物。 但是在临床使用中已经显现了许多副作用。 1.3 萝卜表皮附生乳酸菌 乳酸菌（ lactic acid bacteria）是一类无芽孢、革兰氏 染色 阳性 细菌 的总称，它属于 发酵 糖类，其主要产物为乳酸。 乳酸菌是一群细菌，它们数量相当庞大，种类异常复杂，到目前为止共发现有 200多种，并分成了 18个属。其中相当大的一部分都是我们人体所必须并具有重要生理功能的菌，而且人体的肠道中大量存在着这些菌。并且国内外生物学家都认为人类身体的健康程
11、度和生命的长短都与4 西华大学毕业论文 肠道中的乳酸菌有着非常密切的关系。 乳酸菌的发酵原理是：乳酸菌进行无氧呼吸，葡萄糖即经过糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸再脱氢产生乳酸。乳酸 菌可将 酪蛋白 被分解成肽和氨基酸，而且乳糖和柠檬酸可生成 芳香性 物质，从而产生风味。乳酸球菌和 乳酸杆菌 对蛋白质有较强的分解能力，是高酸生成菌。乳酸菌还有分解脂肪的能力，三 丁酸 甘油酯 易被乳酸菌 发酵剂 分解。 1.4 链霉素 链霉素属于抗生素中氨基糖苷类。 链霉素（ streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式 C21H39N7O12。 1943年美国 S.A.瓦克斯曼 从 链霉菌 中析离得到，是
12、继 青霉素 后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗 结核杆菌 的特效作用，开创了 结核病 治疗的新纪元。链霉素是一种从灰 链霉菌 的培养液中提取的 抗菌素 。属于氨基糖甙 碱性 化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌 蛋白质合成 的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。 链霉素为白色无定形粉末，有吸湿性。易溶于水，不溶于大多数有机溶剂，强酸、强碱条件下不稳定。硫酸链霉素制剂外观为黄色粉末，密度 0.38g/L， pH1.5 3.5，易溶于水，呈微酸性，在中性和酸性条件下稳定，碱性条件下易失效。 1.5 16S rRNA 分析技术在乳酸菌分类学的应用 16S r
13、ibosomal RNA是 16S rRNA 的全名，它是原核生物的一种核糖体 RNA，是原核核糖体 30S小亚基的组成部分。由于其种类少，普遍性存在，分子大小适中，总量一般占细菌 rRNA总量的 80 %左右，在结构与功能上具有高度的保守性和特异性，基因序列一般包含约 50个功能域，基因序列的变化缓慢，所以将 16S rRNA 用作分子指标 , 这样能实现微量、快速、准确、简便的对乳酸菌进行分类鉴定。 16S rRNA中的 “S“是沉降系数，反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标。此沉降系数分为 3种： 5S、 16 S和 23 S，他们对应的编码基因（ rRNA）的链 长为 330
14、0、 1540、 120个核苷酸，细菌蛋白质的合成过程是由它们和核糖体大小亚基组合在一起共同完成的。 16S rRNA基因是细菌上编码 rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。 5 西华大学毕业论文 16S rRNA 基因片段一般有 3 种分析方法 : 第一种是，将 PCR 产物与 16S rRNA 种属特异性的探针杂交，从而获取微生物组成信息。样品与探针也可以直接进行原位杂交检测 ， 这样既能分析它们的空间分布，还能测定微生物的丰度和形态特征。此方法优点是简洁方便， 通常大量应用于快速检测 ,。缺点是可能出现假阴性或假阳性结果。第二种是在质粒载体上将 PCR 产物克隆，然后进行
15、测序。通过将结果与 16S rRNA 数据库中的序列进行比较的方法，找出它在进化树中的位置，这样就可以鉴定出萝卜表面乳酸菌中存在的乳酸菌种类 ,。此方法优点是获得的信息比较全 ,缺点是如果成分太复杂，工作量会很大。第三种是，对PCR 产物进行限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism s,RFLP)分析 , 然后观察其酶切电泳图谱和数值分析来确定萝卜表面乳酸菌基因的核糖体型 , 然后与核糖体库中的数据进行比较，这样可以分析不同种属之间的关系。 随着分子分类的方法和理论的日渐成熟， 16S rRNA分析技术成为了微生物分类学研究的一种
16、可靠的工具。细菌主要是根据是细菌生理、生化性状和形态特征进行分类 , 采用的对乳酸菌进行纯培养分离方法，然后鉴定其生理、生化、形态、反应特征和免疫学特性 4-5。 1.6 本论文研究的目的及意义 随着人们生活水平逐步提高，人们越来越重视食品安全问题。有机蔬菜纯天然、不含任何农药残留，通常被称为“零污染”的蔬菜，因此备受消费者青睐。然而， 近年来 越来越多 抗 生素抗药性 乳酸菌被发现具有一定 可转移 的 抗 药性， 为乳酸菌的安全敲响了警钟。该研究 以期待 为有白机萝卜鲜食的食品安全评价提供参考。 2 材料和方法 2.1 材料和仪器 2.1.1 样品 有机白萝卜样品购买于成都有机蔬菜种植基地零
17、售超市。 6 西华大学毕业论文 2.1.2 试剂 2.1.2.1 DNA 提取与检测试剂 表 1 DNA 提取与检测试剂 试剂 生产厂家 ddH2O 北京奥博星生物技术有限责任公司 TE Buffer 北京奥博星生物技术有限责任公司 10%（ W/V） SDS 北京奥博星生物技术有限责任公司 20 mg/mL 蛋白酶 K 北京奥博星生物技术有限责任公司 5M NaCl 北京奥博星生物技术有限责任公司 CTAB/ NaCl 溶液（ pH8.0） 成都市科龙化工试剂厂 24 1 氯仿 /异戊醇 成都市科龙化工试剂厂 25 24 1 苯酚 /氯仿 /异戊醇 成都市科龙化工试剂厂 异丙醇 成都市科龙化
18、工试剂厂 无水乙醇、 70%乙醇 成都市科龙化工试剂厂 电泳级琼脂糖 成都市科龙化工试剂厂 核酸染色剂 成都市科龙化工试剂厂 DNA Marker I, DNA Marker VII 成都市科龙化工试剂厂 2.1.2.2 PCR 扩增试剂 表 2 PCR 扩增试剂 PCR扩增试剂 生产厂家 4种底物： dNTP (dATP+dCTP+dGTP+dTTP) Tiangen公司 10Taq 缓冲液 Tiangen公司 Taq DNA polymerase ( 5.0U/l ) Tiangen公司 MgCl2（ 25mM） Tiangen公司 PCR mixture 东盛公司 2.1.2.3 16S
19、 rRNA 目的基因的 PCR 扩增 7 西华大学毕业论文 表 3 16S rRNA 目的基因的 PCR 扩增试剂 16S rRNA目的基因的 PCR扩增试剂 生产厂家 10PCR buffer； 东盛公司 脱氧核苷酸（ dNTP 混合物）； 东盛公司 Taq DNA 聚合酶； 东盛公司 DNA 模板； 东盛公司 引物 P1:Eu27f, AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 东盛公司 引物 P2:1490R, GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 东盛公司 三蒸水 东盛公司 2.1.3 仪器 表 4 实验所用仪器及设备 仪器 生产厂家 IS09001 电子天平
20、北京赛多利斯仪器系统有限公司 BCD-155TD GA 冰箱 青岛海尔股份有限公司 DSX-280B 手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 宁波甬安医疗器械制造有限公司 LDZX-75KB 立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂 SW-OJ-LF 洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 PTC-200 型 PCR 扩增仪 美国 MJ Research 公司 DYCP-31DN 型琼脂糖水平电泳仪 北京六一仪器厂 GEL DOC XR 型凝胶成像分析系统 美国 Bio-Rad 公司 2.1.4 培养基及配制 2.1.4.1 MRS 培养基配制方法（配制量 1 L） (1) 称取酵母粉 5g，蛋白胨
21、10g，牛肉膏 10g，葡萄糖 20g，吐温 80 1mL，柠檬酸铵 2g，乙酸钠 5g，硫酸锰 0.05g，硫酸镁 0.2g，磷酸氢二钾 2g，碳酸钙 20g于 1 L的烧杯中； 8 西华大学毕业论文 (2) 加入约 800mL（ 80%）去蒸馏水，加热充分搅拌溶解； (3) 滴加 1mol/LNaOH，调节 pH至 6.56.8； (4) 加去蒸馏水至 1L； (5) 加入 15g琼脂，高温高压灭菌（ 121灭菌 30min），待冷却至 60左右时摇匀倒平板，每个平板的培养基加 20mL左右，平板制成后保存于 4。 2.1.4.2 MRS 液体培养基 (1) 称取酵母粉 5g，蛋白胨 10
22、g，牛肉膏 10g，葡萄糖 20g，吐温 80 1mL，柠檬酸铵 2g，乙酸钠 5g，硫酸锰 0.05g，硫酸镁 0.2g，磷酸氢二钾 2g于 1L的烧杯中； (2) 加入约 800mL（ 80%）蒸馏水，加热充分搅拌溶解； (3) 滴加 1mol/LNaOH，调节 pH至 6.56.8； (4) 加蒸馏水至 1L，充分搅拌均匀后，分装入试管中（ 5mL/支）； (5) 高温高压灭菌（ 121灭菌 30min），保存。 2.2 实验方法 2.2.1 乳酸菌的培养 随机选取有机白萝卜表皮 25 g 放于 225 mL 无菌生理盐水中，振荡 30 min，制成细菌原液。用移液枪取 900l无菌水于
23、 EP 管中，再取 100l细菌原液，混合均匀记为 1:10；吸取 1:10 的细菌液于 900l无菌水中混匀制成 1:100 细菌液；吸取 1:100 的细菌液于 900l无菌水中混匀制成 1:1000 细菌液 ; 吸取 1:1000 的细菌液 900l无菌水中混匀制成 1:10000 细菌液。 配制液体 MRS培养基 200mL，灭菌后倒 10个平板，待其冷却凝固后于恒温箱过夜，用移液枪取 100l菌种于平板，用玻璃涂棒将菌种涂均匀，作好标记，每个浓度的细菌液接两个平板，于 37恒温箱培养 48h6。 2.2.2 乳酸菌的分离纯化 在 MRS固体培养基中加入碳酸钙，将菌种稀释至合适的浓度，均匀涂布于加入碳酸钙后的固体培养基， 37恒温培育 48h。乳酸菌会在含有碳酸钙的培养基上产生溶解圈，观察挑选有碳酸钙溶解圈的单菌落（最好挑一些溶解圈半径较大的），然后在 MRS 固体培养基上反复划线，直到分离长出单菌落。将分离的单菌落编号菌种在 MRS固体培养基上， 保藏温度 4，备用。
