1、仪器分析汇报,孙雁斌,红外光谱分析流式细胞仪激光扫描共聚焦显微镜动态光散射仪核磁共振波谱分析,红外光谱分析（IR）,红外光谱(Infrared Spectroscopy, IR)又称分子振动-转动光谱，属分子吸收光谱。样品受到频率连续变化的红外光照射时，分子吸收其中一些频率的辐射，分子振动或转动引起偶极矩的净变化，使振-转能级从基态跃迁到激发态，相应于这些区域的透射光强减弱，记录百分透过率T%对波数或波长的曲线，即红外光谱。,近红外光谱区：低能电子能级跃迁含氢原子团：-OH、-NH、-CH伸缩振动的倍频吸收峰稀土及过渡金属离子配位化学的研究对象适用于水、醇、高分子化合物、含氢原子团化合物的定量
2、分析 中红外光谱区：分子的振动、转动基频吸收光谱区应用最为广泛的红外光谱区,远红外光谱区：气体分子的转动能级跃迁液体与固体中重原子的伸缩振动晶体的晶格振动某些变角振动、骨架振动-异构体的研究金属有机化合物、氢键、吸附现象研究该光区能量弱,较少用于分析,红外光谱的应用及特点：,应用：推断分子的结构及立体构型；测定分子的键长、键角推断化学键的强弱及极性；计算相关热力学参数等特点：能够更为精细的表征分子结构的差别；测定快速、灵敏度高、试样用量少；能分析各种状态的试样，应用范围广；与色谱等仪器联用具有强大的定性功能,色散型红外光谱仪,产生红外吸收的条件,辐射光子的能量应与振动跃迁所需能量相等。辐射与物
3、质间有偶合作用，产生偶极矩变化。,峰数目分子的振动自由度,振动自由度= 3N -（平动自由度+转动自由度）线性分子：振动自由度= 3N - 5非线性分子：振动自由度= 3N - 6例：水分子,吸收峰数目少于振动自由度的原因：,存在没有偶极矩变化的振动模式存在能量简并态的振动模式，即振动频率相同的峰重叠 振动吸收的强度小，仪器的分辨率分辨不出，从而检测不到某些振动模式所吸收的能量不在中红外光谱区。,吸收峰的位置及影响因素,虎克定律：k：化学键的力常数，与键能和键长有关：双原子的折合原子量任意两个相邻的能级间的能量差为：化学键键强越强，键的力常数k越大,原子折合质量越小，化学键的振动频率越大，吸收
4、峰将出现在高波数区。,电子效应：诱导效应、吸电效应；使吸收峰向高波数方向移动（蓝移）共轭效应：n-共轭效应（中介效应），-共轭效应（C效应）；使吸收峰向低波数方向移动（红移）氢键效应：分子内氢键、分子间氢键；使吸收峰向低波数方向移动（红移）振动耦合：当两个振动频率相同或相近的基团相邻并由同一原子相连时，两个振动相互作用产生共振，吸收谱带裂分，形成双峰（高频和低频）。,费米共振：当一振动的倍频与另一振动的基频接近（2A= B）时，二个振动相互作用而产生强吸收峰或者发生谱带裂分的现象。空间效应:由于空间阻隔，分子平面与双键不在同一平面，此时共轭效应下降，吸收峰蓝移。张力效应:环张力：四元环 五元环
5、 六元环;环外双键随环张力增加，吸收峰蓝移。环内双键随环张力增加，吸收峰红移物质状态：由固态向气态转变时，其红外吸收峰将蓝移。溶剂效应：极性基团的伸缩振动峰随溶剂极性增加而红移。,特征区与指纹区,特征峰：与官能团相联系的、在一定频率范围内出现的化学键的振动吸收峰。特点：吸收峰稀疏、较强，易辨认,指纹区：1300900 cm-1： C-X (X：O、N、F、P、S)、 P-O、Si-O伸缩振动区 900400 cm-1： -CH2平面摇摆、苯环取代、 C-H面外变形振动区特点：吸收峰密集、难辨认,流式细胞仪（FCM）,流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是以激光为光源、检测生物学颗
6、粒理化性质的仪器。流式细胞术（flow cytometry，FCM）是应用流式细胞仪对悬浮液中的细胞或细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞分析技术。同时依赖测量到的参数还可以用物理的方法将一个群体中的细胞亚群分选出来，即流式细胞分选术。,FCM与其他细胞分析技术相比，有如下特点：高速度：每秒可检测1 0005 000个细胞。高灵敏度：每个细胞只要带有1 0003 000个荧光分子就能检出，两个细胞之间有5%的差别就可区分出来，光散射的灵敏度为0.3um。高精度：在细胞悬液中测量细胞，比其他分析技术的变异系数更小，分辨率高。高纯度：分选细胞的纯度可大于99%以上。多参数：可同时定量检测单个细胞的
7、DNA等多个参数。在适当的条件，可对活细胞进行无害性分析和分选。,流式细胞仪基本结构,流式细胞仪基本结构包括五部分：以上整个系统由电子电路和计算机控制，用以收集、显示、分析、储存被测定的各种信号及控制细胞的分选收集。,流式细胞仪基本原理,流式细胞术光信号,散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。前向散射光(forward scatter, FSC)：激光器正前方1 -6度方向上有比较强的衍射光，即前向散射光，FSC强度是d/的函数，反映被测细胞的体积大小和活力。侧向散射光(side scatter, SSC)：SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细
8、胞内部颗粒度和精细结构的变化。,荧光信号（fluorescence，FL）：荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态，再回到低能态时释放出的光。自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）特异荧光：荧光素分子发出的的荧光比自发荧光强很多倍。,细胞信号的显示,一维直方图（histogram）：单参数直方图表示一个参数与细胞数量间的关系，横坐标（X轴）表示荧光或散射光强度的相对值，其单位用在流式细胞仪中用“道”表示，道数与荧光强度之间是线性或对数关系，依仪器分析时放大器的性质而定。纵坐标（Y轴）通常代表细胞出现的频率或相对细胞数量，绝对细胞数较少使用。在直方图中，每个峰表示在某些方面性质相同的一群细胞
9、，若用“标尺”把各峰分开成区间，即可统计分析出各个区间内细胞所占百分比、及光散射或荧光强度的峰值、平均值、标准差、变异系数等。,二维点图（dot plot）：二维点图表示两个参数与细胞数量间的关系。在二维点图中，每个点代表一个细胞，根据细胞性质的不同，在二维点图上就会出现若干群细胞，即为不同的细胞亚群。若用“门”把各亚群细胞分开并进行统计分析，可得各亚群细胞所占百分比、及平均荧光强度等。,假三维图：任选FSC、SSC、FL1FL3中任何两个参数为X轴和Y轴，以细胞数量为Z轴，就构成了三维图。因Z轴细胞数量不是直接测量参数，实际上仍是二维图，故称为假三维图。该图对细胞亚群的观察更为直观。二维等高
10、图：用不同高度的平面切割假三维图，将这些切割投影到X、Y平面上，就形成了等高图，等高图由类似地图上的等高线组成，等高线密集的地方，就是细胞数变化快的地方。该图对观察细胞的分布趋势优于二维点图。,三维图（3D）及四参数平面图：三维图：在FSC、SSC、FL1FL3中任选三个参数为X轴、Y轴和Z轴，就构成了一个三维图，在三维空间中，每一群细胞各处于独立的空间位置。该图对复杂的细胞亚群分析更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难。四参数平面图：四参数平面图分析对数据分布的观察也有一定意义。,直方图 散点图 假三维图,二维等高图 三维图,流式细胞仪的使用,制备合格的单细胞悬液。对需测量的细胞生物化学成
11、分进行荧光标记染色。进行流式细胞仪测量。对测量资料进行定量分析。对测量分析结果在生物学上的意义予以解释。,流式对照的设置,空白对照：设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。同型对照：同型对照是指使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照，用于消除抗体非特异性结合到细胞上而产生的背景荧光。单标对照：由于荧光素的宽发射谱特点，荧光通道间有光谱重叠现象。多色流式实验的时候需要通过补偿调节消除光谱重叠影响。,激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）,激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microsc
12、ope;LSCM):以激光作为光源，激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源， 经过透镜、分光镜形成平行光后，再通过物镜聚焦在样品上，并对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描。样品被激光激发后的出射光波长比入射光长，可通过分光镜，经过透镜再次聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测到，并在显示器上成像，得到所需的荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡，不能通过探测针孔，因而不能在显示器上显出荧光信号。这种双共轭成像方式称为共聚焦。因采用激光作为光源，故称之为“激光扫描共聚焦显微镜”。,激光扫描共聚焦显微镜的基本结构,激光光源扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）自动显微镜控制系统
13、（数字信号处理器、计算机）图象输出设备（显示器、打印机、存储器）,激光扫描共聚焦显微镜的基本原理,利用放置在光源后的照明针孔(P1)和放置在检测器前的探测针孔(P2)实现点照明和点探测；激光经过照明针孔形成点光源，由物镜聚焦在样品焦面的某个点上，只有该点所发射 的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光线被探测器阻挡，不能到达PMT探测器，从而提高了成像效果。照明针孔和探测针孔 共焦，共焦点为被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。,共聚焦显微镜与传统显微镜的区别,Fluorescent Microscope,Confocal Principle,抑制图像的模糊，获得清晰的图像具有更高的轴向
14、分辨率，并可获取连续光学切片增加侧向分辨率由于点对点扫描去除了杂散光的影响,激光扫描共聚焦显微镜的优越性,动态连续扫描及三维图像重组同时多种物质标记瞬时分辨率高高质量数字图像,荧光样品的制备要求,荧光标记反应特异性强，荧光信号定位准确保持样品应有的形态结构的完整性荧光信号响应百准确灵敏，具有可重复性荧光强度适度荧光稳定性好样品的荧光分布均匀图象背景干净，干扰杂质少,激光扫描共聚焦显微镜的应用,细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构等；生物化学：酶、核酸、 FISH 、受体分析等；药理学：药物对细胞的作用及其动力学等；生理学：膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态等；遗传学和组胚学：细胞生长
15、、染色体分析、基因表达、基因诊断等；神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递等；微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构等；病理学及病理学临床应用：活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断等；生物学、免疫学、环境医学和营养学：免疫荧光标记（单标、双标）的定位，细胞膜受体或抗原的分布等。,动态光散射仪,动态光散射Dynamic Light Scattering(DLS)，也称光子相关光谱Photon Correlation Spectroscopy (PCS) ，准弹性光散射quasi-elastic scattering，是一种通过测量样品散射光强度起伏的变化来得出样品颗
16、粒大小信息的一种技术。DLS技术测量粒子粒径，具有准确、快速、可重复性好等优点，还具有测量Zeta电位、大分子的分子量等的能力，已经成为纳米科技中比较常规的一种表征方法,动态光散射仪原理,假设粒子一样大的，有单 一的、良好的扩散系数，且温度保持不变。小颗粒在溶液中“抖 动”相对迅速，就得到一个快速波动的强度信 号。相比之下，大颗粒扩散地更慢，导致强度 信号又慢又大。,从扩散系数获得粒度,散射光强度与时间的关系是符合统计规律，引入“自动相关函数C (t)”，通过拉普拉斯逆转换，将光信号转换成指数光谱的形式进行数据处理，从而将杂乱的强度起伏图就变成了有规则的C( t)平滑曲线。变量是一个的指数函数
17、里特定的衰变时间常数，控制自相关函数C(t)向long-t极限值(基线B)衰变的速度。因此，粒子越大扩散系数越小，产生的波动越慢，衰减时间常数就越大。,通过粒子衰变常数就能够得到的扩散系数D1/= 2DK2或者D =(1/2K2)(1/)k “散射光波矢量”，是一个常数，由溶液中的激光的波长和PMT探测器接收到的散射光散射角决定。K = (4n/) sin /2 K = 1.868105 cm-1（n溶剂折射率；= 90；= 632.8nm）D = kT / 6R（ K玻耳兹曼常数，T温度，溶液的剪切粘度）,动态光散射技术的优点：,样品制备简单，不需特殊处理，测量过程不干扰样品本身的性质，所以
18、能够反映出溶液中样品分子的真实状态测量过程迅速，样品可以回收利用检测灵敏度高能够实时监测样品的动态变化,核磁共振波谱分析（NMR）,将磁性原子核放入强磁场后会发生磁能级分裂，用适宜频率的电磁波照射，处于低能级的原子核发生能级跃迁会吸收能量，同时产生核磁共振信号，得到核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance，NMR）分析测定时，样品不会受到破坏，属于无破损分析方法结构分析的重要工具之一，获取的结构信息丰富,核磁共振的原理,将自旋核置于外磁场H0中时，根据量子力学原理，由于磁矩与磁场相互作用，磁矩相对于外加磁场有不同取向，它们在外磁场方向的投影是量子化的，可以用磁量子数(
19、m)描述： m=I ，I-1，I-2，-I 2I+1个取向其中I是核的自旋量子数，只有I0时原子核才有自旋角动量和自旋现象。,对于具有一定自旋量子数I、磁量子数m的核量子化能级的能量为： H0 ：外加磁场强度 ：核磁子 ：核磁矩 相邻两个能级的能量差：当用频率为的电磁波照射被外磁场分裂了的自旋1H核且满足：1H核自旋产生的磁场与外磁场发生相互作用，磁矩的取向发生改变，即处于低能态的核吸收了射频能量而跃迁至高能态，发生了核磁共振吸收。,原子核在自旋的同时，还以外磁场方向为轴线发生回旋，这种回旋运动称为拉摩尔进动： 0自旋角速度 0进动线频率 磁旋比当电磁波的照射频率与进动频率0相等时， 发生核磁
20、共振吸收，核磁矩取向发生改变。,核有自旋(磁性核)有外磁场时，能级裂分照射频率满足：,固定磁场，改变射频频率，扫频法，较困难固定射频频率，改变磁场，扫场法，通常用,连续波核磁共振仪,脉冲傅里叶变换核磁共振波谱仪,不是通过扫场或扫频产生共振；恒定磁场，施加全频脉冲，产生共振，采集产生的感应电流信号，经过傅立叶变换获得一般核磁共振谱图,样品的制备,试样浓度： 510%，0.10.5mol/L； 需要纯样品15-30 mg； 傅立叶变换核磁共振需要纯样品1 mg ；标准样品：四甲基硅烷 TMS；溶剂：四氯化碳，二硫化碳、重水；氘代溶剂：氯仿、苯、二甲基亚砜的氘代物。,化学位移,在有机化合物中，各种1H核所处的化学环境不同，周围的电子云密度也不同，共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移的现象化学位移的标准物质：四甲基硅烷Si(CH3)4 (TMS)，屏蔽强烈，位移最大，与有机化合物中的质子峰不重迭,规定其位移常数TMS= 0,1H NMR谱,峰的数目：标志分子中磁不等性质子的种类；峰的强度(面积积分)比：每类质子的相对数目；峰的位移值()：每类质子所处的化学环境；峰的裂分数：相邻碳原子上质子数；偶合常数(J)：确定化合物构型。氢谱仅能确定质子，与红外谱图联合解析结构。,
