1、一 名 词 解 释1. 细胞培养：用酶消化法讲组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜的条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。2. BSS 溶液：平衡盐溶液，是人工合成培养基的基础成分，也常用来洗涤组织细胞，其主要成分是无机盐和葡萄糖，无机盐构成细胞的生命成分，维持细胞渗透压既其生存环境的稳定。葡萄糖供给细胞生存所需的能量。其中含少量酚红作为溶液酸碱度的指示剂。Hanks 液是常用的 BSS 液。3. 原代细胞培养：又称为初代细胞培养，从机体去的材料（细胞、组织或器官），在培养瓶内培养到第一次传代前。4. 传代培养或传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接
2、种到新的培养器皿中。5. 组织块培养法：将组织块剪切成小块，直接送入培养瓶（皿）中，贴附一段时间后，细胞从组织块长出，最终形成单层细胞。6. 细胞系：原代细胞首次传代成功后即可成为细胞系7. 细胞株：通过筛选或克隆化，且有特殊性质或特异标记的细胞，这些特性在以后的培养中必须存在。这些特性包括：具有一定的标记染色体，对某种病毒的敏感性或抗性，以及具有特殊的抗原性等。8. 接触抑制：当一个细胞被其他细胞阻挡而无去处时就停止移动，接触区域的细胞膜皱褶样活动停止，这样保证了细胞不会重叠生长。9. 密度抑制：正常细胞生长汇合成单层时，细胞密度达到一定程度时，细胞即停止分裂的现象。10. 合 成 培 养
3、基 （ synthetic medium） 是 通 过 顺 序 加 入 准 确 称 量 的 高 纯 度 化 学 试 剂 与 蒸馏 水 配 制 而 成 的 ， 其 所 含 的 成 分 （ 包 括 微 量 元 素 在 内 ） 以 及 他 们 的 量 都 是 确 切 可 知的 。 合 成 培 养 基 一 般 用 于 实 验 室 中 进 行 的 营 养 、 代 谢 、 遗 传 、 鉴 定 和 生 物 测 定 等 定量 要 求 较 高 的 研 究11. 有 丝 分 裂 指 数 ： mitotic index 一个细胞群体中正在进行有丝分裂的细胞的百分数。12. 悬浮培养：在流动的液体培养基中培养非贴壁的
4、悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。二、细胞培养技术的优缺点？优点：1.得到的是活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态结构、生命活动 2.可控制：选择对象、性质、调节条件。3. 应用广， 学科多： 对象广。各种动物：低等动物-高等动物 -人类一种动物：不同年龄不同组织: 正常或异常（肿瘤）4.较经济：花钱较少但可得到大量、同时、重复性好的生物学性状相似的实验对象5. 不易污染环境缺点：1. 现人工无法完全模拟体内环境 a. 失去彼邻关系 b.失去神经体液的调节和细胞相互间的影响2. 细胞趋向单一化3.失去原有组织结构和细胞形态 4.分化减
5、弱或不显要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。5. 某些类型细胞还很难培养6.大规模培养难度大三、体外细胞培养的方式及特点？1、粘附型培养: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。粘附是大多数有机体细胞在体内外生存和生长发育的基本存在方式2、悬浮型培养: 不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。来源: 来自血，脾或骨髓， 尤以血中白细胞.癌肿细胞也可以.特点:在悬浮中生长良好,细胞圆形，单个或小细胞团 优点 : 生存空间大，提供数量大,传代方便 (不需消化),易于收获可获得稳定状态.缺点:观察不方便 , 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)四、体外培养细胞的生
6、长形态分类？主要 2 类： 上皮样、成纤维细胞样 、其它不定型上皮样细胞型。 来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物, 消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核 易相连成片相靠紧密相连 成薄层铺石状成纤维细胞样细胞 。 培养中形态与成纤维细胞类似 来源：中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮细胞 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出 23 个长短不等的突起中有卵圆形核五、解释下列常用术语：1).细胞系（ cell line）： 2).细胞株： 3).原代培养：
7、4).n 传代 培养： 5).转染（transfection）：6).lipofection：1.细胞系（cell line）：原代培养物首次传代后，就可以称细胞系。不能或有限传代下去称有限细胞系。能连续传代的称连续细胞系。2.细胞株：某类细胞经传代克隆并保持了该类细胞理化特征的细胞群体。3.原代培养：直接取自生物体的组织细胞并进行培养。4.传代培养：将细胞从一个培养物内分散到另一个培养物的过程。5.转染（transfection）：将某个基因转移到培养细胞核内。6.lipofection：常用细胞转染剂（脂质体），它搭载基因（DNA ）后形成复合物可转染到动物细胞。 六、细胞培养的条件及设备
8、？a.细胞培养室b.常用设备 1. 超净工作台； 2. 纯水装置；3. 抽气泵；4. 消毒装置；5. 干燥装置；6. CO2 培养箱(孵箱)；7. 液氮生物容器；8. 冰箱；9. 离心机 10. 天平 11. 显微镜 12. 过滤装置 13. 空调 14. 酸度计 15. 干燥器七.、原代培养技术的过程？取材漂洗剪切消化计数接种（具体可以看课本）八.、传代培养技术过程？传代培养技术： 去旧换新液消化分装九、每代细胞基本的生长过程？1. 游离期 细胞接种后最初一段时间, 细胞在培养基中呈悬浮状, 胞体圆形.2. 贴壁期 细胞附着于支持物上3. 潜伏期 细胞活着但无分裂. 细胞株 624h 原代
9、2496h4. 指数增长期 细胞增殖旺盛, 数量成倍增多, 最适合实验研究. 35d 以后来到.5. 停止期( 衰退期) 细胞长满瓶壁, 有活力, 不增殖, 能存活一段时间. 如传代进入下一循环.十、细胞培养技术的应用？1、基本生长特点、活动及细胞周期 2、细胞遗传学3、细胞内蛋白、酶及其它物质的定性、定量分析（细胞化学、免疫组化和荧光定量等）4、分子生物学 a.DNA 分离、分析 b.基因导入 c.基因表达的原位检测5、生物技术 a.疫苗的制备 b.细胞工程抗体6、药物开发药理、毒力和药效试验7、细胞分化 ,如干细胞研究8、肿瘤学研究发生、发展、浸润、转移和转化等9、细胞衰老、凋亡2、乳鼠心
10、肺组织块原代培养的方法1)取材：将乳鼠断髓用镊子夹尾，将鼠身浸入 75%酒精中旋转 3s取出后，置小鼠于培养皿中（已消毒）固定小鼠于操作台用安尔碘消毒胸廓部位皮肤在胸部中线处用 2 把镊子撕开小鼠胸部皮肤剪开胸腔，去除胸骨用弯头镊子取出小鼠心肺组织置于已加入 Hanks 液的青霉素瓶2）漂洗：用 Hanks 液冲洗小鼠心肺组织 2 次3）剪切：置组织块于青霉素瓶一角，眼科剪用力反复剪切组织 2 分钟4）制备：用胶头吸管转移并涂布组织于 25ml 培养瓶加全培养液于对面2 小时后翻转培养瓶3、培养细胞的分型细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为贴壁依赖性细胞（包括大多数动物非淋巴组织细胞核
11、许多异倍体肿瘤细胞）、非贴壁依赖性细胞（来源于血液淋巴组织的细胞、杂交瘤细胞、某些肿瘤细胞核转化细胞）。贴附型细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。只能贴附在带适量正电荷的固体或半固体表面上生长。贴附型细胞的分型1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型、扇形或星形, 中央有圆形核,胞质向外伸出 23 个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。起源：细胞来自中胚层间充质组织。除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管
12、内皮细胞。注意：细胞在培养时成为成纤维型细胞是一种惯称,与体内细胞不同。2.上皮型细胞(epithlium cell type) 来自外胚层。特点：扁平不规则多角型、圆形核、角为钝角，大小相仿。细胞外观透明，细胞彼此紧密相连成单层膜；边缘细胞很少脱离细胞群而单独活动“ 拉网” 现象与起源内外胚层组织有关。组织: 皮肤表皮及其衍生物(汗腺、皮脂腺)消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。3. 游走型细胞(wandering cell type)特点：起源于网状内皮系统的细胞皆属本型。在支持物上散在生长,不连接成片, 胞质伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动,速度快不规则, 密度大连接成片呈多角形不易与其
13、他类型的细胞 区别。4. 多形型细胞(polymorphic cell type)特点： 无规律的形态，如神经细胞。形态特征并非一成不变，易受培养条件的影响。悬浮型特点： 不贴附在支持物生长，胞体圆形，在培养液中生长空间大，可长时间的生长，繁殖旺盛便于做细胞代谢研究。S180 肉瘤、血液里的白细胞、K562、 HL60。分型的目的：方便描述细胞在培养过程中的形态变化。培养条件好时，细胞相对稳定，可反映出起源、正常异常的区别，作为判定细胞生物学性状指标。强调：一般形态并不是一项可靠指标要受各方面影响。如：反复开关温箱、温度、C02 的浓度、培养基变碱、支原体、pH 值。细胞在接种时呈三角型状态，
14、经培养一定时间后，细胞在传代前已形成上皮型细胞。4、细胞传代的方法1）取 1/2 原培养液置于 50ml 培养瓶2）去除剩余培养基，加 Hanks 液冲洗组织块，去除剩余 Hanks 液3）加入 1 管胰酶，静置 30s，去掉多余的胰酶，剩少许继续消化 10 分钟4）加 2 管完全培养基于 25ml 培养瓶并沿瓶壁冲洗细胞5）转移细胞悬液至 50ml 培养瓶，再加入 2 管培养基6）置于 37、5%培养箱中培养。5、细胞冻存、复苏的原则与方法原则：慢冻快融实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或 DMSO（二甲基亚砜）作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓
15、慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。冻存的方法1、预先配制冻存液10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液）2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液， 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106 细胞/ml）3、加入 1ml 细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。液氮长期保存复苏的方法1、快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入 37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在 1
16、分钟内全部融化（不要超过 3 分钟）。2、解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除 DMSO。3、如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。6、玻璃器皿的清洗1）旧的：浸泡煮沸 10min刷洗流水冲洗 15-20 次烘干泡酸 24h流水冲洗 15-20 次沥干三蒸水浸泡 2 次（每次 24h）烘干包装2）新的：5%稀盐酸泡过夜刷洗流水冲洗 15-20 次三蒸水浸泡烘干、包装7、器械清洗和消毒的步骤严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的，其方法
17、分为物理法和化学法两类。前者包括干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，后者主要指使用化学消毒剂等。热灭菌：玻璃器皿，160170，90120min 或 1804560min。蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用 68kPa(115) 高压灭菌 10min；布类、玻璃制品、金属器械等用 103kPa(121.3)高压灭菌 1520min。滤过除菌：分正压、负压式滤过消毒。适于含有不耐热成分的培养基和试剂的除菌，用孔径为 0.22m微孔滤膜可除去细菌和霉菌等，用此滤膜过滤两次，可使支原体达到
18、某种程度的去除，但不能除去病毒。紫外线：紫外线的波长为 200300nm，最强是在 254 nm，615 平方米最少一只紫外灯，高度要在 2.5m 以下，湿度 45%60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，实验前应不低于 30 分钟的照射时间。熏蒸消毒：当遇有细胞培养出现多次污染，或实验室两个月一次的常规消毒，均可用高锰酸钾 57.5g，加甲醛（40%）1015ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭 24 小时，致少 4 小时以上。煮沸消毒：紧密情况时使用，金属器械和胶蹇在水中煮 2030 分钟，趁热倾去水分即可使用。化学消毒：化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微
19、生物的化学制进行消毒灭菌的方法。实验室桌面、用具及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒杀菌。常用的有：2%煤酚皂溶液（来苏尔）、0.25%新洁尔灭、1%升汞、35%甲醛溶液、75%酒精。8、原代培养的肺细胞和复苏的肺癌细胞各自的形态特征9、细胞冻存的意义、操作步骤和注意事项冻存的意义：可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。注意事项：1从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；2将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3冻存和复苏最好用新配制的培养液。4.冷冻细胞体积占冷冻管体积的 1/2.2
20、、细 胞 培 养 基 本 条 件（1 ） 合 适 的 细 胞 培 养 基 合 适 的 细 胞 培 养 基 是 体 外 细 胞 生 长 增 殖 的 最 重 要 的 条 件 之 一 ,培 养 基 不 仅 提 供 细 胞营 养 和 促 使 细 胞 生 长 增 殖 的 基 础 物 质 ,而 且 还 提 供 培 养 细 胞 生 长 和 繁 殖 的 生 存 环 境 . （ 2） 优 质 血 清 目 前 ,大 多 数 合 成 培 养 基 都 需 要 添 加 血 清 .血 清 是 细 胞 培 养 液 中 最 重 要 的 成 分 之 一 ,含有 细 胞 生 长 所 需 的 多 种 生 长 因 子 及 其 它 营
21、 养 成 分 . （ 3） 无 菌 无 毒 细 胞 培 养 环 境 无 菌 无 毒 的 操 作 环 境 和 培 养 环 境 是 保 证 细 胞 在 体 外 培 养 成 功 的 首 要 条 件 .在 体 外 培养 的 细 胞 由 于 缺 乏 对 微 生 物 和 有 毒 物 的 防 御 能 力 ,一 旦 被 微 生 物 或 有 毒 物 质 污 染 ,或者 自 身 代 谢 物 质 积 累 ,可 导 致 细 胞 中 毒 死 亡 .因 此 ,在 体 外 培 养 细 胞 时 ,必 须 保 持 细 胞 生存 环 境 无 菌 无 毒 ,及 时 清 除 细 胞 代 谢 产 物 . （ 4） 恒 定 的 细 胞
22、生 长 温 度 维 持 培 养 细 胞 旺 盛 生 长 ,必 须 有 恒 定 适 宜 的 温 度 . （ 5） 合 适 的 气 体 环 境 气 体 是 哺 乳 动 物 细 胞 培 养 生 存 必 需 条 件 之 一 ,所 需 气 体 主 要 有 氧 气 和 二 氧 化 碳 . 细 胞 培 养 基 种 类 与 基 本 成 分 细 胞 培 养 基 的 种 类 很 多 ,按 其 来 源 分 为 合 成 培 养 基 和 天 然培 养 基 (目 前 使 用 的 培 养 基 绝 大 部 分 是 合 成 培 养 基 ),按 其 物 质 状 态 分 为 干 粉 培 养 基 和 液体 培 养 基 两 类 .干
23、粉 培 养 基 需 由 实 验 者 自 己 配 制 并 灭 菌 ,液 体 培 养 基 由 专 业 商 家 提 供 ,用 户 可 直 接 使 用 ,非 常 方 便 .每 种 细 胞 都 有 其 合 适 的 培 养 基 ,2、细 胞 培 养 基 本 条 件（1 ） 合 适 的 细 胞 培 养 基 合 适 的 细 胞 培 养 基 是 体 外 细 胞 生 长 增 殖 的 最 重 要 的 条 件 之 一 ,培 养 基 不 仅 提 供 细 胞营 养 和 促 使 细 胞 生 长 增 殖 的 基 础 物 质 ,而 且 还 提 供 培 养 细 胞 生 长 和 繁 殖 的 生 存 环 境 . （ 2） 优 质 血
24、 清 目 前 ,大 多 数 合 成 培 养 基 都 需 要 添 加 血 清 .血 清 是 细 胞 培 养 液 中 最 重 要 的 成 分 之 一 ,含有 细 胞 生 长 所 需 的 多 种 生 长 因 子 及 其 它 营 养 成 分 . （ 3） 无 菌 无 毒 细 胞 培 养 环 境 无 菌 无 毒 的 操 作 环 境 和 培 养 环 境 是 保 证 细 胞 在 体 外 培 养 成 功 的 首 要 条 件 .在 体 外 培养 的 细 胞 由 于 缺 乏 对 微 生 物 和 有 毒 物 的 防 御 能 力 ,一 旦 被 微 生 物 或 有 毒 物 质 污 染 ,或者 自 身 代 谢 物 质 积
25、 累 ,可 导 致 细 胞 中 毒 死 亡 .因 此 ,在 体 外 培 养 细 胞 时 ,必 须 保 持 细 胞 生存 环 境 无 菌 无 毒 ,及 时 清 除 细 胞 代 谢 产 物 . （ 4） 恒 定 的 细 胞 生 长 温 度 维 持 培 养 细 胞 旺 盛 生 长 ,必 须 有 恒 定 适 宜 的 温 度 . （ 5） 合 适 的 气 体 环 境 气 体 是 哺 乳 动 物 细 胞 培 养 生 存 必 需 条 件 之 一 ,所 需 气 体 主 要 有 氧 气 和 二 氧 化 碳 . 细 胞 培 养 基 种 类 与 基 本 成 分 细 胞 培 养 基 的 种 类 很 多 ,按 其 来
26、源 分 为 合 成 培 养 基 和 天 然培 养 基 (目 前 使 用 的 培 养 基 绝 大 部 分 是 合 成 培 养 基 ),按 其 物 质 状 态 分 为 干 粉 培 养 基 和 液体 培 养 基 两 类 .干 粉 培 养 基 需 由 实 验 者 自 己 配 制 并 灭 菌 ,液 体 培 养 基 由 专 业 商 家 提 供 ,用 户 可 直 接 使 用 ,非 常 方 便 .每 种 细 胞 都 有 其 合 适 的 培 养 基 ,7 细 胞 传 代 要 点 与 注 意 事 项细 胞 传 代 方 法贴壁细胞（1）洗掉旧培养液；（2）、用无钙镁 PBS 洗涤细胞一至二次；（3）、加入适量 Tr
27、ypsin-EDTA 溶液方法一：37或温室作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆颗粒状时，洗掉消化液，轻敲培养瓶边缘使细胞自瓶壁脱落，然后加入适量的新鲜培养液，与脱落的细胞或细胞团块混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。方法二：37或室温作用数分钟，待细胞自瓶壁脱落后，加入适量含血清的新鲜培养液，以终止 trypsin 作用，离心后除去上清液，或不作离心处理，添加新鲜培养基后依稀释比例传至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。悬浮型细胞（1）、吸去细胞培养液，放入离心管中，离心 1000rpm、5min（2）、吸除上清液，加入适量的新鲜培养基，与沉淀细胞混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养。
