1、坐骨神经腓肠肌标本的制备和神经干动作电位的观察与传导速度的测定1、实验目的：1.学习蛙类动物双毁髓的实验方法。2.学习并掌握坐骨神经-腓肠肌标本的制备方法。3.观察蛙坐骨神经干复合动作电位的基本波形，并了解其产生的原理。4.学习蛙和蟾蜍离体神经干上神经冲动传导速度的方法和原理。2、实验材料：1.实验对象：蟾蜍2.实验器材：常规手术器械（粗剪刀、手术剪、眼科剪、手术镊、眼科镊）蛙板、蛙钉、探针、锌铜弓、玻璃分针、培养皿、任氏液、滴管、手术线、PC 机、信号采集处理系统、神经屏蔽盒等。3、实验原理：神经干在受到有效刺激以后可以产生复合动作电位，标志着神经发生兴奋。如果在离体神经干的一段施加刺激，从
2、另一端引导传来的神兴奋冲动，可以记录出双相电位，加入在引导的两个电极之间将神经干麻醉或损伤，阻断其兴奋传导能力，这时候记录出的动作电位就成为单相电位。神经细胞的动作电位是以全或无的方式产生的。但是，复合动作电位的幅值在一定刺激强度下是随刺激强度的增加而增大的。如果在远离刺激点的不同距离处分别引导离体神经干动作电位，两引导点之间的距离为 m，在两引导点分别引导出的动作电位的时相差为 s。即可按照公式 v=m/s 来计算出兴奋的传导速度。蛙类的坐骨神经干属于混合性神经，其中包含有粗细不等的各种纤维，其直径一般为 3-29um,其中直径最粗的有髓纤维为 A 类纤维，传导速度在正常室温下为 35-40
3、 m/s。神经每兴奋一次极其在兴奋以后的回复过程中，其兴奋性都要经历一次周期性的变化，其全过程依次包括绝对不应期、相对不应期、超常期和低常期 4个时期。为了测定坐骨神经在发生一次兴奋以后兴奋性所发生的周期性变化，首先要给神经施加一个条件性刺激引起神经兴奋，然后在前一兴奋及其恢复过程不同时相再施加一个测试性刺激，用于检查神经的兴奋阈值和所引起的动作电位的幅度，以判定神经兴奋性的变化。四、实验方法及步骤：1、坐骨神经干标本制备（1） 破坏脑与脊髓：取蛙一只，用自来水冲洗干净，左手持蛙，用食指下压其吻部，拇指按压在其骶髂关节下方，使其头尽量前俯，右手持探针沿两眼之间中线向后方轻划，至触及头颈部正中的
4、凹陷处，即为枕骨大孔的位置。用探针在凹陷处垂直刺入枕骨大孔，再将其针尖转向前刺入颅腔，左右搅动探针，彻底捣毁脑组织；然后缓慢地把探针退至枕骨大孔处，将其转向后方，与脊柱平行捻动探针使其刺入整个椎管，彻底捣毁脊髓。彻底捣毁脊髓时，可看到动物后肢突然蹬直，然后瘫软。（2）剪去躯干上部及内脏在骶髂关节前 1 cm 处用金冠剪（粗剪）剪断脊柱（可在下肢前端） 。沿脊柱切口向下剪开两侧腹部皮肤至耻骨处，将头、前肢、内脏及腹部软组织全部剪掉，放于污物盘，只保留下端脊柱和下肢。在腹侧脊柱两旁可看到腰骶神经丛。注意切勿触及或损伤坐骨神经。（3）剥后肢皮肤左手持镊子夹住脊髓断端，右手捏住断端边缘，剥掉全部后肢皮
5、肤。注意不要握住或接触坐骨神经。将全部皮肤剥除后，把标本置于盛有任氏液的培养皿中。将手和手术器械洗净，以免皮肤分泌物、血液污染神经标本。（4）分离两腿在任氏液里把标本上的血迹冲洗干净，用镊子从背位夹住脊柱将标本提起，剪去向上突出的骶骨（避开坐骨神经） ，然后沿正中线用粗剪刀将脊柱分为两半，再从耻骨联合中央剪开两后肢。将已分离的标本浸入盛有任氏液的培养皿中。（5）制备坐骨神经标本取出一侧下肢，用蛙钉固定于蛙板上，固定时要注意使坐骨神经和腓肠肌朝上。先用玻璃分针沿脊柱侧游离坐骨神经，神经干应尽可能分离的长一些。要求上自脊髓附近的主干，下沿腓总神经或胫神经一直分离至踝关节附近止。坐骨神经在膝关节后分
6、为胫神经和腓神经两支，如要制备腓神经，则在分叉的下端将胫神经剪断，膝关节附近的腓神经表面有肌肉和筋膜覆盖，仔细分离并沿腓肠肌沟一直下行分离至跟踺，然后将棉线用任氏液浸泡后，在脊髓侧坐骨神经起始处和跟腱处将神经结扎，在结扎的外侧将神经干剪断，制成坐骨神经-腓神经标本。另外，也可保留胫神经而将腓神经剪断，制成坐骨神经-胫神经标本。将制备好的神经干标本浸于任氏液中数分钟，待其兴奋性稳定后开始实验。注意在分离过程中，应把神经周围的结缔组织去除干净，并把神经的细小分支剪断，但要注意不要用金属器械碰触神经，也不要对神经过度牵拉。实验期间应不断滴加任氏液使神经保持湿润。制备好的标本应如下：图 1 坐骨神经腓
7、肠肌标本示意图2、神经干动作电位的观察（1）连接实验装置：将刺激电极连接刺激输出，记录电极连接到 1 通道和 2 通道，注意避免接触不良或连接错误，注意地线的连接。（2）将神经标本置于神经屏蔽盒的电极上 将神经的近中枢端置于刺激电极上，外周端置于记录电极上。（3）进入生物信号采集处理系统，设置参数进行测定。5、实验结果及讨论：1.神经干动作电位：所测得蟾蜍坐骨神经干复合动作电位图如下，神经干受刺激后，记录的动作电位即为双相动作电位。神经干AP毫 秒 （ 时 间 ）图 1 蟾蜍神经干复合电位2.神经干动作电位的传导速度测定本实验采用两个通道同时记录由两对引导电极记录下的动作电位来计算动作电位传导
8、速度。先分别测量从刺激伪迹到两个动作电位起始点的时间，设上线为t1，下线为 t2，求出 t2-t1 的时间差值。然后再测量标本屏蔽盒中两对引导电极起始电极之间的距离 d，则神经冲动的传导速度 Vd/(t2-t1)。通过实验，我们测得 t1=1.9ms，t2=2.2ms，d=1cm，V33.33m/s。相比标准值（35-40）来说偏低，可能因为神经纤维放置时间过长，不够湿润而使传导速度下降。六、注意事项：1、在制备标本时，避免过度牵拉神经，不可用手或金属器械触碰神经干。2、避免动物皮肤分泌物（蟾酥、血液等）污染神经和肌肉，也不要用水冲洗，以免影响组织机能。3、制备标本时，要随时用任氏液润湿神经和肌肉，防止干燥。4、分离神经时，一定要把周围结缔组织剥离干净。5、实验要迅速，以免时间过长影响标本活性（兴奋性） 。
