1、实验方案一.【实验题目】：土壤中细菌的分离纯化实验二.【实验设计思想】：细菌是具有很高实用价值的一类微生物, 世界各国对其研究与资源开发极为重视. 目前, 国内有关细菌的区系调查及资源开发虽然有一些报道, 但对不同作物根际细菌的研究很少. 甘肃天水麦积山海拔 1742m , 属黄土高原潮湿区, 植物生长土壤区有机质含量丰富,本次实验将以该地区的落叶松、马尾松、白岩松、野豌豆等作物生长地区的土壤为材料, 分离鉴定其中的细菌, 探讨不同作物根际土壤中细菌分布数量及种类的差异, 并且分析每一种菌种在植物生长过程中所起的作用，最后以此为依据来推断麦积山大片地区内土壤中微生物的分布丰富情况和它们对植物生
2、长作出的巨大贡献.三.【实验目的】：1.学会培养基最基本的制备方法。2.学会最基本的微生物灭菌、接种等基本操作过程。2.掌握最基本的分离、纯化微生物的一系列操作操作。四.【试验方法】：取天水麦积山不同植物根部的土壤作为土样，通过对其土壤中微生物的一系列培养、分离、筛选最终分离出细菌得菌株，并稀释平板菌落计数法进行数量测定四实验原理:1.菌种来源：由于各种细菌对营养物质需求不同，在不同地方采样对选取所要的细菌含量和其它杂菌含量的多少直接有关，所以选择微生物含量有可能丰富的土壤（天水麦积山植物根区）中采样。2.培养基的选取：为了使所要的细菌能很好的生长，其它微生物生长受到一定的抑制，要用选择培养基
3、。还要把细菌与其他微生物相区别，还要用鉴别培养基。为了达到既是选择培养基又是鉴别培养基，选取牛肉膏蛋白胨培养基。3.培养及分离纯化：通过涂布培养法、平板划线法等方法达到分离纯化的目的。4.保藏：通过分离纯化得到的菌种，接种与斜面培养基上，到一定时间后进行传代培养保藏，使其不死亡、减少突变所引起的生物学性状的改变。5.通过形态与染色鉴定：由于各种微生物有其特定的菌落形态特征和单细胞形态特征，可通过这些形态进行鉴定。还由于细胞壁组成不同可进行鉴别染色法进行鉴定，也可用产生不产生芽孢进行芽孢染色。通过以上方法可对所分离纯化的菌种进行初步的鉴定。6.通过生理生化反应进行鉴定：各种微生物在代谢类型上表现
4、了很大的差异，如表现在对对大分子糖类和蛋白质的分解能力，以及分解代谢的最终产物的不同，反映出他们有不同的酶系。我们在实验室允许的条件下做了糖类发酵与氧化、是否能产生过氧化氢酶以及是否含有细胞色素氧化酶等生理生化试验，进行再次鉴定。五【.实验材料】：1.器材：玻璃烧杯、天平、搪瓷烧杯、三角瓶、量筒、漏斗、试管、培养皿、吸管、培养基分装器、电炉、接种环、移液枪、PH 试纸（PH5.49） 、牛角匙、牛皮纸、棉花、纱绳、高压蒸汽灭菌锅等。2.牛肉膏、蛋白胨、NaCl、1mol/LNaCl、1mol/LHCl。六实验步骤：1.配置牛肉膏蛋白胨培养基：(1).配方及其配量：牛肉膏 0.3g，蛋白胨 1g
5、NaCl 0.5g,琼脂粉 1.5g水 100ml注：PH7.27.4，每份如此，根据需要可改变量进行配置。（2）.称取药品:按培养及配方与配量分别称取药品，取少于总量的水于烧杯中，将各个培养及成分（琼脂除外）逐一加入水中待溶。（3） 加热溶解：将玻璃被放在石棉网上（搪瓷烧杯可直接用文火加热） ，用文火加热并不断搅拌，促使各药品快速溶解，然后补充水分之所需培养基的量。（4）调节 PH 值：初配好的牛肉膏蛋白胨培养液是微酸性的，故需用1mol/LNaOH 调 PH 至 7.2-7.4。为避免调解时过碱，应缓慢加入 NaOH 液，即要边滴加 NaOH 边搅匀培养液，然后用 PH 试纸侧其酸碱度值。
6、检测培养基的 pH，若 pH 偏酸，可滴加 1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸检测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱，则用 1mol/LHCl 进行调节。pH 的调节通常放在加琼脂之前。应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度.（5）.过滤:液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基此步可省略(6)分装:披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的 15，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积
7、内一半为宜。半固体培养基以试管高度的 1/4 为宜灭菌后垂直待凝。(7). 加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利透气的作用。要使棉塞总长约 35 塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的透气，则可用 8 层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料盖代替棉塞。(8)包扎:加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。 若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。(9)灭菌:将上述培养基于
8、121湿热灭菌 20min。如因特殊情况没能及时灭菌，则应放人冰箱内暂时保存.（10）摆斜面 灭菌后，待培养基冷却至 5060，然后制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上,并调整斜度,使斜面长度不超过试管总长的一半.（11）.无菌检查:将灭菌的培养基放入 37温箱中培养 24-48h, 无菌生长时可以使用,或放置在冰箱或清洁的橱内,备用.2.配置无菌生理盐水：称 0.85g NaCl 至盛有 100ml 蒸馏水的三角瓶中，塞上棉塞，塞外包上一层牛皮纸，至加压蒸汽灭菌锅内在 121下灭菌 20min 即为无菌生理盐水。3 取样并制备土壤稀释液：（1）.土壤前处理; 取出采集的土样，去除其中较
9、大的杂质，将其撵碎、撵细待用。（2）制土液：称出 10 克于带有无菌玻璃珠的 250ml 锥形瓶中，用已灭菌的量筒量取 90ml 无菌水溶解，振摇约 20 分钟，使土样与水充分混匀。点燃酒精灯在火焰附近，用无菌移液枪从中吸取 1ml 土壤悬液加入盛有 9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌移液枪从此试管中吸取 1ml 加入另一盛有 9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成 10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 不同稀释度的土壤溶液。4 .涂布接种：将上述 9 个平板分别贴上标签 10-4、10-5、10-6 各三个，然后用无菌移液枪分别由 10-4、10-5
10、、10-6 三管土壤稀释液中各吸取 0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中 ，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，室温下静置 5到 10 分钟，使菌液吸附进培养基。【注意：所有的接种工作必须在无菌室里面进行，在接种之前必须先进行灭菌】5培养。30 摄氏度恒温室中培养 3 天6 .观察并进一步分离纯化。观察菌落特征，并记录。再倒两个平板。点燃的酒精灯附近，从稀释度合适的培养平板上挑取带有溶磷圈的菌落，在新制的平板上划线分离，30 摄氏度恒温室中培养 3 天7斜面培养 放置斜面。挑取单个菌落接种到 3 个斜面上培养。置于2830恒温箱中培养h.与此同时，用单菌落进行以下鉴定试验革兰氏染色
11、1.1 涂片 常规涂片法 1.2 初染 滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于涂片上，染色 12min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色。 1.3 媒染 用碘液媒染约 l min ，水洗。 1.4 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加 95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，干燥。 1.5 复染 在涂片上滴加番红液复染约 23min ，水洗，然后用吸水纸吸干。1.6 镜检 干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。1.7 清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然
12、后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。芽孢染色(1）将培养的菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加 35 滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约 45 分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约 76）染 10 分钟。（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。（5）用番红水溶液复染 1 分钟，水洗。（6）待干燥后，置油镜观察，七.计数：常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬
13、液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：一般选取菌落数在 30300 之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入 O0012，3，5 一氯化三苯基四氮唑(TTC)；本法限用于形成菌落的微生物另活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。将待测样品经一系列 10 倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取 0.2ml 放入无菌平皿，再倒入适量的已熔化并冷至 45 左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数： 每毫升原菌液活菌数同一稀释度三个以上重复平皿 菌落平均数稀释倍数 5 此法还可以将稀释的菌液取 0.2m 1 加到已制备好的平板上，然后用无菌涂棒将菌液涂布整个平板表面，放入适宜温度下培养，计算菌落数，再按上公式计算出每毫升原菌液的所含活菌总数。 七实验结果.（等待中）
