1、项目名称： 重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究首席科学家： 桂建芳 中国科学院水生生物研究所起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部门： 中国科学院 湖北省科技厅一、研究内容基于拟解决的鱼类分子设计育种的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的可行性途径这两个关键科学问题，本项目拟集中在鱼类主要经济性状如生殖、生长、抗性的功能基因组和分子设计育种的基础方面，重点解析这些主要经济性状的基因调控网络，开拓关 键技术，其主要研究内容包括： 1）鱼类生殖基因调控网络及其分子设计育种的基础研究采用基因转移、morpholino 介导的基因敲降等技术 ，配合整体原位杂交、细胞示
2、踪和免疫荧光定位等方法，重点解析鱼类生殖质(germ plasm)的基因调控网络；揭示重要生殖调控基因在鱼类卵母细胞成熟和卵-胚转换中的功能作用及其调控机制；探讨鱼类配子发生过程中双亲特异性甲基化在生殖调控中的作用及其及其调控网络；通过大规模 RFLP 分析等呈现技术，筛选雌雄个体间性别特异的DNA 片段 标记， 进而通过 Genomic Walking 克隆分离与性 别决定和性别分化相关基因；揭示鱼类性别决定和性别分化的基因调控网络及其作用机理；筛选鉴定出可用于鱼类分子设计育种的性别特异表达基因和分子标记；开拓生殖调控基因和分子标记用于鱼类分子设计育种的可行性途径。2）鱼类生长的基因调控网络
3、和分子设计育种的基础研究采用 morpholino 介导的基因敲降、整体原位 杂交、细胞示踪、免疫荧光定位以及组织碎片灌流和细胞孵育等在体和离体研究等技术，重点解析鱼类下丘脑/垂体控制生长的基因调控网络；揭示鱼类性成熟和生长的相互协调及其调控机理；探讨脑肠肽/生长激素/类胰岛素生长因子信号通路及其对鱼类生长的调控机制；揭示卵泡抑素等抑肌素相关基因在调控鱼类肌肉细胞增殖和鱼肉蛋白/脂肪平衡的作用机理；研制可控不育性转卵泡抑素等基因的转基因鱼品系；阐明鱼类个体大小调控基因的系统发育和进化规律；开拓生长基因调控网络和分子标记尤其是主控基因用于鱼类分子设计育种的可行性途径。3）鱼类抗性的基因调控网络和
4、分子设计育种的基础研究利用我们自主建立的分离鱼类抗病毒基因的细胞模型，重点解析鱼类干扰素系统和抗菌肽基因的调控网络和抗病作用机理；揭示重要鱼类病原与宿主免疫系统的相互作用及其作用机制；探讨在鱼类抗病免疫反应中主效基因调控网络、功能和抗病机理；研制具有抗病性状的雌核发育系和近交家系；鉴别出与鱼类抗病性状密切相关的分子标记和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立鱼类抗病分子设计育种的理论和技术方法，开拓其可行性途径。采用大规模测序和基因芯片分析等手段，通过比较转录组学和基因功能分析等研究手段，解析鱼类抗寒基因调控网络及其作用机理，揭示低温胁迫下不耐寒鱼类基因表达谱与耐寒鱼类基因表达谱的差异及其关键基
5、因的功能；创制鱼类抗寒机理研究模型，开拓鱼类 抗寒基因用于分子设计育种的可行性途径。4）鱼类分子设计育种的关键技术研究通过建立鱼类数量性状基因调控网络信息整合技术和鱼类经济性状主效基因的图谱定位，揭示鱼类经济 性状主效基因同线性和性状关联性关系，阐明鱼类经济性状主效基因转录组以及它们在群体和家系中的功能，确定鱼类经济性状主效基因标记和基因不同组合的遗传效应，评估其育种效率，由此创建可用于鱼类分子设计育种的数量性状多基因聚合育种的技术路线。通过创制基于蛋白分子设计、BAC 克隆、转座子系统、Cre/lox 基因靶位操作的稳定、高效的鱼类转基因技术， 优化和完善基于蛋白质锌指结构的鱼类基因快速敲除
6、系统，创建基于破坏原生殖细胞发生或维持的具有遗传安全的鱼类转基因技术体系等建立可用于鱼类分子设计育种的基因操作技术路线，并揭示性腺特异小 RNA 在基因表达调控中的作用，阐明 piRNA 与互作蛋白的调控途径，研制出持续激活的生长激素受体基因的转基因鱼，揭示持续转激活生长激素受体基因与转生长激素基因的转基因鱼的效应及其信号通路的调控差异。二、预期目标本项目的总体目标： 针对水产养殖业发展现状和可持续发展需求，通过开展重要养殖鱼类生殖、生长和抗性等主要经济性状的功能基因组研究，解析鱼类生殖的基因调控网络、鱼类生长的基因调控网络、 鱼类抗病和抗寒的基因调控网络，筛选鉴定进行分子设计育种的主控或关键
7、基因和分子标记，建立鱼类分子设计育种的关键技术及其技术体系，在理论上阐明 鱼类生殖、生 长、抗病和抗寒等主要经济性状和重要生命现象的基因调控网络及其作用机理，提出鱼类良种分子设计的策略；在技术方法上，建立鱼类分子设计 育种的多基因聚合和基因操作技术，创制优质育种材料，创建 鱼类分子设计育种的可行性途径。通过这些研究，使我国在鱼类功能基因组研究中居国际领先水平， 为培育高产优质养殖新品种奠定理论和技术基础，为我国水产养殖业的可持续发展和渔业生物技术的创新做出贡献。五年预期目标: 1. 解析鱼类生殖、生长、抗病和抗寒的基因调控网络；2. 筛 选 鉴 定 具有自主知识产权、可 用 于 鱼 类 分 子
8、 设 计 育 种 的 功能 基 因 和 分 子 标 记 30 50 个 ；3. 揭示鱼类性别决定与分化、卵母细胞成熟和卵-胚转换的分子机制；4. 阐明鱼类生长激素分泌的信号通路； 5. 阐 明 鱼 类 干扰素系统关键基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用机理；阐明鱼类抗寒关键信号通路及其作用机理；6. 建立鱼类数量性状多基因聚合育种技术；7. 创建基于蛋白分子设计和遗传安全的稳定高效的基因操作技术；8. 建立主要经济性状功能基因组研究和分子设计育种中间的有机联系，创制 23 个在生殖、生长 或抗性等目标经济性状上表现优质的育种材料；9. 凝聚和培养一批有国际影响的中青年学术带头人和学术骨干；发表
9、一批高质量的学术论文，其中在有重要国际影响的期刊（相关领域引用排名前 15%的期刊或影响因子大于 5 的期刊）发表论文 50 篇以上。三、研究方案（一）、学术思路： 针对水产养殖业发展现状和可持续发展需求，以鲫和鲤等为主要研究对象，启动我国重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究，通过研究鱼类生殖、生长和抗性的基因调 控网络及其作用机理， 筛选鉴定进行分子设计育种的关键基因和分子标记，建立 鱼类分子设计育种的关键技术及其技术体系，解决鱼类分子设计育种的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的可行性途径这两个关键科学问题，为鱼类分子 设计育种的实践和应用以及为我国水产养殖业的可持续健康发展和渔
10、业生物技术的创新做出贡献。（二）、技术途径： 1. 采用 solexa 深度测序等大规模测序和基因芯片分析等手段，通过比较转录组学分析，了解鱼类生殖和生长不同阶段、以及抗病和不抗病、耐 寒和不耐寒的基因表达谱差异，经生物信息学比较和分子特征分析，由此筛选调控鱼类生殖、生长、抗性的主要基因和关 键基因；2. 建立重要鱼类基因组 BAC 库，研究基因的结构，克隆分离相应基因的启动子；将其启动子与 GFP 报告基因重组融合，利用基因转移等技术，采用流式细胞仪等筛选分析技术，进一步研究生物学功能；3. 建立鱼类 BAC 转基因技术，用杂交方法或 PCR 方法筛选重要功能基因的 BAC 克隆，在基因 编
11、码 框的适当位置插入绿色荧光蛋白（EGFP）基因；利用以上构件制备转基因鱼，通过 EGFP 分析这些基因的 时空表达情况及其生理学效应；4. 通过基因连锁分析和原位杂交等技术，研究目的基因在染色体上的定位，揭示基因相互作用的基因组组织基础；5. 用 RT-PCR、原位杂交和 Western blot 方法在 mRNA 及蛋白水平上检测基因表达的组织特异性和时序性;用免疫荧光定位确定其基因的蛋白 产物的组织、细胞和亚细胞定位； 6. 采用染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）、凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility
12、 Shift Assay，EMSA）等技术研究 DNA与蛋白的相互作用；7. 采用免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation， Co-IP）、GST-pull down、荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）等技术研究蛋白相互作用；对一些重要蛋白进行质谱分析、并对其进行泛素化、乙酰化和磷酸化等修饰分析；8. 鉴定两性生殖鲫鱼卵子中双亲特异性甲基化、发育不等性基因，分析单性生殖鲫鱼三倍体卵子中相关同源基因启动
13、子 CpG 岛甲基化差异和基因表达调节差异，确定发生差异甲基化的目标基因；比较分析两性生殖与单性生殖鲫鱼卵子基因组中差异甲基化功能基因启动子，鉴定差异甲基化顺式调控序列。9. 采用正常的和人工突变后的基因转移试验， 辅以其它分子生物学方法如目的基因表达产物体内、外诱导处理等来分析目的基因的生理功能；10. 用显微注射方法研究基因功能。将含有这些基因的真核表达载体，或在大肠杆菌中表达出的蛋白，注射到胚胎中或转染到细胞中，观察生物学效应；11. 将目的基因的反义 RNA 或其蛋白的抗体注射到胚胎中，观察生物学效应；12. 对生殖调控基因而言，设立人工性反转实验，分别提取不同性反转阶段实验组和对照组
14、性腺的 mRNA 和蛋白，采用上述方法研究基因表达的 时序性；13. 对生长和生殖功能基因而言，合成重要 调控生长生殖基因的结构类似物或表达具有生物活性重组蛋白，取鱼类的下丘脑、垂体、肝 脏和性腺，通过碎片灌流和细胞孵育等离体研究方法，或直接注射结构类似物或重组蛋白，采用放射免疫测定等方法研究其活性，测定各种靶组织、血清中调控生殖生长激素的含量，分析这些生长调控因子和生殖调控因子的相互作用及其信号传递机制，分析它们对鱼类生殖和生长的影响；14. 通过体外合成小分子 RNA，建立鱼类系统中适用于实验室日常工作的、简洁、高效的 siRNA 技术 平台；通过克隆获得的鱼类 来源的启动子构建针对草鱼出
15、血病病毒的 siRNA 载体，建立抗病 转 siRNA 基因 鱼模型；通过 Cre-loxp 介导的系统进行鱼类胚胎中的条件基因打靶研究；建立鱼类胚胎干细胞和生殖干细胞系，建立鱼类培养细胞体外基因操作和个体重建技术途径；15. 通过 morpholino 介导的基因敲降技术，配合整体原位杂交、细胞示踪等方法，研究目的基因的生理学功能及其基因调控网络、信号通路和作用机理等；16. 采用已经建立的细胞模型，研究病毒与宿主细胞的相互作用，在此基础上，通过转染目的基因和 siRNA 干扰等技术手段，研究目的基因的生理学功能以及基因的调控网络；17. 通过 AFLP 和微卫星等遗传标记的大规模筛选，鉴定
16、出与鱼类性别等等主要经济性状相关的分子遗传标记，进而通过 Genomic walking 克隆鉴定相关功能基因；通过人工选育和家系分析，利用遗传标记进行基因型分析的优势，研究特定标记与某些经济性状（例如生长、性别、抗病或抗寒）的连锁关系， 进行分子标记辅助育种；开展鱼类生长、饲料转化率等经济性状的 QTL 定位分析和 eQTL定位分析；18. 改造基于蛋白质锌指结构的基因敲除载体系统，优化基因敲除载体，引入更多的克隆位点，以简化特异基因敲除载体的构建；利用 Zinc Finger Tools 网上软件包（www.zincfingertools.org ）,选取代表性基因进 行锌指结构域的索寻，
17、选择连续 20 或 30 个氨基酸的合适结构域，依据针对 DNA 三联体的经验锌指氨基酸序列，设计靶标多肽和碱基序列；将靶标多肽的 DNA 片段克隆到经改进后的基因敲除载体上；体外合成 mRNA,显微注射；观察表型，并利用 PCR 检测显微注射个体的基因型，获得杂合体；将杂合体个体扩大培养，并进行相互交配，以 获得基因的两个拷贝均缺失的纯合体；系统分析基因缺失纯合体的表型。技术途径的示意图如下： 细胞示踪等研究细胞发育命运方法、胚胎细胞移植等体外孵育或灌流结合放射性免疫测定研究生理功能DNA 甲基化分析启动子分析morpholino 介导、siRNA 干扰等基因敲降方法基于蛋白质锌指结构的基因
18、敲除模式鱼类（斑马鱼、青鳉、河豚、三棘刺鱼等）全基因组信息前期已获得的大量与鱼类生殖、生长和抗性相关基因资源已建立的大批鱼类细胞系鱼类生殖、生 长和抗性的主控基因和分子标记的功能揭示和作用机理阐明比较转录 基因组分析Western、免疫组化、WISH 等研究时空表达 谱等方法Co-IP、GST-pull down、FRAP、FRET、BiFC 等研究蛋白相互作用方法ChIP、EMSA 等研究核酸与蛋白相互作用等方法FACS、蛋白质质谱分析、蛋白 质泛素化、乙酰化等修 饰分析鱼类分子设计育种数量性状多基因聚合技术鱼类分子设计育种的基因操作技术多基因信息整合性状的 QTL 与 eQTL 分析基因同
19、线性与性状关联性分析蛋白分子设计、基于蛋白质锌指结构的基因敲除方法、BAC 或Tol2 转座子、Cre/lox 、PGC 操作、miRNA 和 piRNAs 调控鱼类生殖、生长和抗性基因调控网络的解析鱼类分子设计育种的策略和可行性途径（三 ）、创 新 点 与 特 色 ： 1) 重要的研究对象，体现了国家重大需求导向：本项目以我国重要养殖鱼类鲫、鲤等为主要研究对象， 围绕水产养殖业可持续健康发展和渔业生物技术创新所要解决的鱼类分子设计育种的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的可行性途径这两个关键科学问题开展研究，着眼于解决国家中长期发展中所需要解决的重大科学问题，体现了重大的国家需求导向。2)
20、独特的研究体系，注重发挥中国特色和优势：银鲫多倍体的遗传背景和同时具有的雌核发育生殖和有性生殖双重生殖方式以及性逆转鱼类奇特的性别分化现象为解析鱼类生殖和性控的基因调控网络提供了新颖、独特的研究体系，有利于发挥我国的特色和优势。3) 新 颖的 学 术 思 路 ，起到前瞻性、战略性和引领性作用： 本项目瞄准了国际上有关鱼类分子设计育种的难点和热点问题，试图直接通过解析鱼类生殖、生长和抗性的基因调控网络来阐明其调控机理，筛选鉴定可用于鱼类分子设计育种的关键基因和分子标记，由此创建鱼类分子设计育种的关键技术及其技术体系，对指导并推动我国水产业的可持续健康发展具有重要的前瞻性、战略性和引领性作用。（四
21、）、可行性分析： 1) 厚实的前期研究基础，目标明确：鱼类等水产动物的分子设计育种研究虽然还处于起步阶段，但可喜的是，随着斑马鱼、河 鲀和青鳉等模式鱼类全基因组测序的完成和基因功能研究的不断深入，一些重要养殖鱼类的功能基因组研究已进展很快，特别是我们这个团队在上一期 973 计划 “重要鱼类品种改良的遗传和发育基础研究”的支持下，已筛选鉴定出一批与我国主要养殖鱼类的生殖、生长、抗性等 经济性状相关的基因和分子标记，建立了 10 多个养殖鱼类细胞系，积累了厚实的前期研究基础。本项目的研究内容是在这些基础上进一步凝聚而来，目标更为明确。2) 精干、务实的研究团队，成效突出： 本项目集中了中国科学院
22、、中国水 产科学研究院、中山大学、浙江大学、武汉大学等相关科研单位和高等院校在本领域的优秀人才，具有强烈的使命感和责任感，经过五年的合作，已取得了相当高的学术成绩，主要学术带头人在项目执行过程中发表了高水平的学术论文，有的还获得国家杰出青年科学基金资助，已形成一支经过磨练、对科学有执着追求、精干、 务实、高效的研究团队，成为本项目顺利实施的人才保证。3) 坚实、完善的研究基地，支撑有力：本项目利用淡水生态与生物技术国家重点实验室、有害生物控制和资源利用国家重点实验室和多个部门重点开放实验室研究基地的研究条件，这些实验室拥有完善的一流研究设备，先进的研究条件，是顺利完成本项目的坚实支撑和重要物质基础。（五）、 课题设置围绕项目所要解决的鱼类分子设计育种的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的可行性途径这两个关键科学问题，以及项目所要达到为鱼类分子设计育种的实践与应用和为我国水产养殖业的可持续健康发展与渔业生物技术的创新做出贡献的预期目标，根据 项目所要进行的主要研究内容（研究鱼类生殖、生长、抗性的基因调控网络及其作用机理， 筛选鉴定可用于分子设计育种的关键基因和分子标记，建立鱼类分子 设计育种的关键技术及其技术体系），项目共设置6 个课题。 项目的主要研究内容、 课题设置的思路、各课题间的联系和与项目拟解决的关键科学问题和总体目标的关系如下图所示。
