1、表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前,载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素:(1)复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。(2)抗生素抗性基因可以便于加以检测,如 Amp+ ,Kan+(3)多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段(4) P/E 启动子/ 增强子(5)Terms 终止信号(6)加 poly(A)信号可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建
2、的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述 3 点:【1】构建 DNA 重组体的目的,克隆扩增/基因表达,选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型:(1)克隆载体的克隆能力据克隆片段大小(大选大,小选小)。如10kb 选质粒。(2)表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭, E.coli/哺乳类细胞表达载体。(3)对原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能
3、产生阅读框架错位。综上所述,选用质粒(最常用)做载体的 5 点要求:(1)选分子量小的质粒,即小载体(11.5kb )不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);(2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般 10 个以上的拷贝,而严谨型质粒10 个。(3)必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;(4)必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr(试一试)。(5)满足自己的实验需求,是否需要包装病毒,是否需要加入荧光标记,是否需要加入标签蛋白,是否需要真核抗性(如 Puro、G418)等等。无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进
4、行切割,获得线性载体分子,以便于与目的基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步:首先看 Ori 的位置,了解质粒的类型(原核/真核/ 穿梭质粒)第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。(1)Ampr 水解 内酰胺环,解除氨苄的毒性。(2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。(3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。(4)neor( kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使 G418(长那霉素衍生物)失活(5)hygr 使潮霉素 失活。第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而
5、便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步:再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说,外源 DNA 片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。第五步:是否含有表达系统元件,即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。第六步:启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号(1)启动子促进 DNA 转录的 DNA 序列,这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码序列的上游,是 DNA 分子上可以与 RNApol 特
6、异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。(2)增强子/沉默子为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子负增强子,负调控序列。(3)核糖体结合位点/起始密码/SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是 AUG(起始密码)和 SD 序列。(4)转录终止序列(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列,此位点 down stream 有一段 GT 或 T 富丰区,这 2 部分共同构成 p
7、oly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列,此位点 down stream 有一段 GT 或 T 富丰区,这 2 部分共同构成 poly(A)加尾信号。质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条 DNA 链,即质粒是环状双链 DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上 .根据表达宿主不同,构建时所选择的载体也会不同。二、目的基因的获得 一般来说,目的基因的获得有三种途径:调取基因:根据目的基因的序列,设计引物从含有目的基因的 cDNA 中通过PCR 的方法调取目的基因,链接到克隆载体挑取单克隆进行测序,以获得想要的基因片段
8、,这种方法相对成本较低,但是调取到的基因往往含有突变,还有不同基因的表达丰度不同,转录本比较复杂,或是基因片段很长,这些情况都很难调取到目的基因。全基因合成:根据目的基因的 DNA 序列,直接设计合成目的基因。此方法准确性高,相对成本会高一些,个人操作比较困难,需要专业的合成公司完成。优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列,同时可以进行密码子优化,提高目的基因在宿主内的表达量。三、克隆构建 目前,克隆构建的方法多种多样,除了应用广泛的酶切链接以外,现在还有很多不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤。实验材料实验试剂试剂名称 生产厂家载体 pCDNA3.1 T
9、ransheep大肠杆菌菌株 DH5 Tiangen 限制性内切酶 FermentasT4 连接酶 Fermentas质粒 DNA 小,大量抽提试剂盒 Axygen 凝胶回收试剂盒 Axygen琼脂糖 BiowestDNA ladder Fermentas(2)X 基因慢病毒载体的构建X 基因基因由 Transheep 全基因合成,构建于载体 PUC57 中。PUC57-X 基因 EcoRI/BamHI 酶切结果:酶切完成后进行胶回收2. 载体用 pCDNA3.1 双酶切,酶切体系如下。20ul 酶切体系 37 度 3 小时4ul pCDNA3.1 载体(500 ng/ul)1ul BamHI
10、1ul EcoRI2ul 10buffer 12 ul H2O酶切完成后胶回收(见附录)处理好的目的片段与载体连接反应体系:6ul PCR 酶切回收片段(约 50ng/ul)1ul 酶切好的载体(约 50ng/ul)2ul ligase buffer1ul T4ligase10ul H2O以上连接液在 16过夜。转化 (感受态细胞 : DH5a),具体步骤见附录转化部分。抗性: Amp; 37,培养过夜转化后 X 基因分别平板挑菌, 37 250 转/分钟摇菌 14 小时,PCR 鉴定后,将阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。X 基因慢病毒载体单克隆菌落 PCR 鉴定(使用载体通用引物,PCR 条带大小应比实际大 200bp 左右):