1、经常有战友对一些常见问题在丁香园反复问答了很多遍，所以希望园子中一些战友，特别是低分与 0 分战友，能将好的帖子归纳总结了一下，并结合自己的经验整理，一方面这是个学习提高的过程，另一方面也能帮助大家解决这方面的问题。同时如有不当或不完善的地方，希望各位战友不断补充，争取有朝一日我们能把园子里战友的经验系统整理，给大家以帮助。我先把设计引物如何设计酶切位点这方面的帖子整理一下，因为昨天一下子看到三个相似问题。原帖如下：我想向你求教一个问题,假如说我想把胰岛素基因和腺病毒载体连接起来,如何确定设计目的基因 PCR 时的引物呢?和相应的限制性核酸内切酶呢?谢谢老师能给予讲解,谢谢整理：最初的时候，由
2、于害怕设计酶切位点最后切不开，所以经常采用最通用的方法，用 T 载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。但这就需要你仔细设计引物。连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行 PCR 扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用
3、（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的， ，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。我看 promega 的说明书上说，最好隔四个。还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如 AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。 两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补） ，否则效果相当于单酶切。最好使用酶切效率高的。最好使用双酶切有共同 buffer 的酶。最好使用较常用的酶（如 hind3，bamh1，ecor1 等） ，最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。Tm 的计算，关于 Tm 的
4、问题，很多的战友都有疑惑。其实园子里有很多的解释了。Tm 叫溶解温度（melting temperature, Tm） ，即是 DNA 双链溶解所需的温度。大家可以理解，这个温度是由互补的 DNA 区域决定的，而不互补的区域对 DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的 Tm，只有和模板互补的区域对 Tm 才有贡献。计算 Tm 时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补） 。不少战友设计的引物都 Tm 过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm 里了，最后的结果是导致了 PCR 反应的诸多困难。所以，设计引物的时候，先不管 5端的修饰序列，把互补区的 Tm 控制在 55 度以上
5、（我喜欢控制在 58以上，具体根据 PCR 的具体情况，对于困难的 PCR，需要适当提高 Tm） ，再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。Tm 温度高的引物就比较容易克服 3发卡、二聚体及 3非特异结合等问题。简单的计算公式可以用 2+4 的公式。若你计算的 Tm 值达到了快 90 ，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为 29、33 个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为 17、21 个碱基。引物公司给的单子是 70 多度，实际用的只有50 度，用 55 度扩的结果也差不多。其
6、它关于 Tm 值的计算，有用 PP5.0 进行评价的，需要考虑的参数包括：base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。退一般退火温度为 Tm-5 度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，如上所言，PCR 几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你 Tm 值低些（这样可能会增加非特异性），Tm 值是你包括酶切位点及保护碱基的 Primer 计算出来的。1.一般在 5端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入 T-VECTOR 或者其它的载体的话,酶切时可
7、以不需加保护碱基 2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意。关于引物二聚体，最好用 primer 或是其他设计引物的软件进行计算一下，看看引物之间的G（自由能）的绝对值，如果小于 10，一般是问题的。如果稍大，PCR 时可以提高一下退火温度，一般是没有问题的。如果 3端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果 PCR 没有条带，建议重新设计引物。此外，所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时也可以降低二聚体的G。在设计酶切位点时，最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。这是因为，一个特异性引物一般都是 20bp 左右，再加上酶切位点序列和保护性碱基，大致
8、就是28bp 左右了。而我们在设计退火温度时，与引物的长度有关，比正常的引物(20bp) 的 Tm 肯定要高一些。如果我们能利用引物自身的部分序列，就可以有效地减少引物的长度。还有，有些酶是离不开末端序列的，因此，在设计一个酶位点时，最好把该酶的性质弄清楚设计时限制性酶切位点是应该在 5端的顶端。在设计引物时，常在 5端添加酶切位点，以利于 PCR 产物连接到载体。 设计引物时保证在最后 5 个核苷中含有 3 个 A 或 T。先用软件设计出合适的引物，引物的 3端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物 3端的第一位碱基是 A。 （容易错配）引物 3端最佳碱基的选择是G 和
9、 C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物 5端而不影响特异性。当计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。酶切位点都需要保护碱基以利于内切酶的有效切割。酶切位点前加保护碱基 1，两个酶切点至少隔上 3 个碱基，在做载体构建的时候设计引物扩增片段进行定向连接，除了酶切位点，还要在两端加一个三个核苷酸的保护序列，否则PCR 产物很难被酶切，因此就会导致连接失败，因为内切酶需要一定的辅助性碱基才能顺利切割，在没有辅助碱基的情况下，有的酶是可以切割的，比如：SalI 和 SpeI，他们不需要辅助性碱
10、基即可切割，但大部分酶是需要辅助性碱基的。所以引物顺序应是：5保护碱基+酶切位点+引物配对区3下面是几个战友的讨论，请问：在引物的 5端加限制酶切位点，只在酶切位点的 5端加保护碱基可以吗？还是必须要在酶切位点的两侧加保护碱基？是的，只要在 5端加保护碱基可以了。其实保护碱基就是要给限制性内切酶一个结合位点，3端还有更长的引物序列在，当然不需要再加保护碱基了， 下面就来讨论一下这个问题：（下面引自 NEB 网站）1、寡核苷酸近末端位点的酶切为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。 （这里用的是寡核苷酸！而不是末端
11、带酶切位点的肽链！）实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时） ，或者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用。然后 NEB 就提供了一个表，关于链长和切割效率的。我觉得这只能说明酶在作用于识别位点时所需占据的链长，并不能说明在设计酶切位点时要加那么长的保护碱基，比如我用的 NotI，要加 10 个碱基，切 25 个小时才 95的效率，这还是用了 20 倍的酶量！我师姐只加了 4 个碱基，也没见出现问题。2、线性载体近末端位点的酶切将线性载体与相应内切酶（10 units/g）在适宜温度及缓冲液条件下反应 60分钟，随后进行连接和转化。切割效率=100%-(酶切产物转
12、化子数/再连接产物转化子数)“近末端碱基对数“指的是从识别位点到 DNA 末端的碱基对数，但并不包括最初切割位点处留下的单链突出碱基。 （解释一下：就像下面这个例子EcoRI 酶切位点NNNG AATTCNNC TTAAG它的近末端碱基对数就是 3，而不是 4）还没有证据表明单链核苷酸能否提高切割效率，因此在设计 PCR 引物时应至少加上 4 个额外碱基。Not I 7 100 (2) Bluescript SK- Spe I4 100 (1) Bluescript SK-Ksp I1 98 (2) Bluescript SK Xba I 拿 NotI 为例，我觉得 NEB 给出的这个表的意思
13、是，用 Spe I 切 Bluescript SK载体，得到带 7 个近末端碱基对的 NotI 酶切位点，切 1 小时，效率是 100，以次类推。也就是说只有带 4 个末端碱基就能达到 100的效率，而不是像 1所说的要加 10 个碱基，切 25 个小时。因为那是针对寡核苷酸的。这是我的理解，欢迎大家讨论。因为我发现很多人都是依据那个表来加保护碱基，不管是求助还是应助别人。然后在 5端直接加上所需的限制性酶切位点而无需考虑引入的位点和模板的互补配对情况另外保护碱基是不是也不需要与模板对应位置配对以前讨论过这个问题，其实保护碱基的问题可以归纳为几条：1）大多数常用酶，根据 NEB 公司切割线性化
14、的双链 DNA 片段的实验数据添加， 2）某些比较常用的酶，根据 NEB 公司双酶先后切割的实验数据解决，参考的文件是 NEB 公司提供的，见附件3）有些人随意添加 3-6 个碱基，也是一种做法，我不太赞同，毕竟不同的酶对保护碱基的要求差别很大4）最通用的方法，用 T 载体克隆解决问题1。由于内切酶在识别位点时要求位点的两侧都有几个碱基，设计引物的时候，要在位点的外侧至少再加几个碱基？比如 3 个碱基酶切位点引物。2。进行 PCR 时，是不是要先在较低的温度下反应几个循环，就是以不含酶切位点时引物的 Tm10 度，然后再在较高温度做，把引物、酶切位点、额外加入的碱基都包括在内，得到的 Tm10
15、 度。退火温度通常都是不考虑加入的酶切位点及保护碱基的，但要考虑发卡结构，及错误引发率之类的这一段时间为了换载体，重新设计引物花了不少工夫，学了不少东西，希望能和你共勉：1.上下游引物前端个加一个限制性核酸内切酶位点，加保护碱基并不是你所说的“内切酶在识别位点时要求位点的两侧都有几个碱基” ，只要求在引物 5端加保护碱基；如你需要在上游引物上加 Bam H（5-GAAGCC-3）酶切位点，那么你的保护碱基可以为 C、CG 或 CGC，选择哪一个根据你的需要，是否影响Primer 的 Tm 值。关于保护碱基的问题，你可以查 new England 的相关资料。Linearized vectors
16、 were incubated with the indicated enzymes (10 units/g) for 60 minutes at the recommended incubation temperature and NEBuffer for each enzyme. Following ligation and transformation, cleavage efficiencies were determined by dividing the number of transformants from the digestion reaction by the numbe
17、r obtained from religation of the linearized DNA (typically 100-500 colonies) and subtracting from 100%. “Base Pairs from End“ refers to the number of double-stranded base pairs between the recognition site and the terminus of the fragment; this number does not include the single-stranded overhang f
18、rom the initial cut. Since it has not been demonstrated whether these single-stranded nucleotides contribute to cleavage efficiency, 4 bases should be added to the indicated numbers when designing PCR primers. Average efficiencies were rounded to the nearest whole number; experimental variation was
19、typically within 10%. The numbers in parentheses refer to the number of independent trials for each enzyme tested (from Moreira, R. and Noren, C. (1995), Biotechniques, 19, 56-59). Note: As a general rule, enzymes not listed below require 6 bases pairs on either side of their recognition site to cle
20、ave efficiently. EnzymeBase pairs from End%Cleavage Efficiency Vector Initial CutAat II 3 2 1 88 (2) 100 (2) 95 (2) LITMUS 29 LITMUS 28 LITMUS 29 Nco I Nco I PinA I Acc65 I 2 1 99 (2) 75 (3) LITMUS 29 pNEB193 Spe I Sac I Afl II 1 13 (2) LITMUS 29 Stu IAge I 1 1 100 (1) 100 (2) LITMUS 29 LITMUS 29 Xb
21、a I Aat II Apa I 2 100 (1) LITMUS 38 Spe IAsc I 1 97 (2) pNEB193 BamH IAvr II 1 100 (2) LITMUS 29 Sac IBamH I 1 97 (2) LITMUS 29 Hind IIIBgl II 3 100 (2) LITMUS 29 Nsi IBsiW I 2 100 (2) LITMUS 29 BssH IIBspE I 2 1 100 (1) 8 (2) LITMUS 39 LITMUS 38 BsrG I BsrG I BsrG I 2 1 99 (2) 88 (2) LITMUS 39 LIT
22、MUS 38 Sph I BspE I BssH II 2 100 (2) LITMUS 29 BsiW IEag I 2 100 (2) LITMUS 39 Nhe IEcoR I 1 1 1 100 (1) 88 (1) 100 (1) LITMUS 29 LITMUS 29 LITMUS 39 Xho I Pst I Nhe I EcoR V 1 100 (2) LITMUS 29 Pst IHind III 3 2 1 90 (2) 91 (2) 0 (2) LITMUS 29 LITMUS 28 LITMUS 29 Nco I Nco I BamH I Kas I 2 1 97 (1
23、) 93 (1) LITMUS 38 LITMUS 38 NgoM IV Hind III Kpn I 2 2 1 100 (2) 100 (2) 99 (2) LITMUS 29 LITMUS 29 pNEB193 Spe I Sac I Sac I Mlu I 2 99 (2) LITMUS 39 Eag IMun I 2 100 (1) LITMUS 39 NgoM IVNco I 2 100 (1) LITMUS 28 Hind IIINgoM IV 2 100 (1) LITMUS 39 Mun INhe I 1 2 100 (1) 82 (1) LITMUS 39 LITMUS 3
24、9 EcoR I Eag I Not I 7 4 1 100 (2) 100 (1) 98 (2) Bluescript SK- Bluescript SK- Bluescript SK- Spe I Ksp I Xba I Nsi I 3 3 2 100 (2) 77 (4) 95 (2) LITMUS 29 LITMUS 29 LITMUS 28 BssH II Bgl II BssH II Pac I 1 76 (3) pNEB193 BamH IPme I 1 94 (2) pNEB193 Pst IPst I 3 2 1 98 (1) 50 (5) 37 (3) LITMUS 29
25、LITMUS 39 LITMUS 29 EcoR V Hind III EcoR I Sac I 1 99 (2) LITMUS 29 Avr IISal I 3 2 1 89 (2) 23 (2) 61 (3) LITMUS 39 LITMUS 39 LITMUS 38 Spe I Sph I Sph I Spe I 2 2 100 (2) 100 (2) LITMUS 29 LITMUS 29 Acc65 I Kpn I Sph I 2 99 (1) LITMUS 39 Sal I 2 1 97 (1) 92 (2) LITMUS 39 LITMUS 38 BsrG I Sal I Xba
26、 I 1 1 99 (2) 94 (1) LITMUS 29 LITMUS 29 Age I PinA I Xho I 1 97 (2) LITMUS 29 EcoR IXma I 2 2 98 (1) 92 (1) pNEB193 pNEB193 Asc I BssH II 寡核苷酸近末端位点的酶切 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时） ，或者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上 6
27、 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用 - 32PATP 在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A260单位的寡核苷酸。取 1 g 已标记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶，在 20C 条件下分别反应 2 小时和 20 小时。反应缓冲液含 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT 及适量的 NaCl 或 KCl（视酶的具体要求而定） 。20%的PAGE（7 M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低切割率%酶 寡核苷酸序
28、列 链长2 hr 20 hrAcc I GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl III CACATGTG 8 0 0 CCACATGTGG CCCACATGTGGG10 1290 9090 90Asc I GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 1290 90 9090 90 90Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 90 9090 90 90BamH I CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 121
29、0 90 9025 90 90Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 90 90BssH II GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 90BstE II GGGT(A/T)ACCC 9 0 10BstX I AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 90Cla I CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 90 500 0 90 50
