1、1进出口动物源性食品中三聚氰胺快速检测方法 ELISA 法编制说明一、 标准制定的任务来源及意义本标准的制定工作是由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口，由北京出入境检验检疫局研究起草，计划编号为 2008B184。本标准制定了进出口动物源性食品中三聚氰胺快速检测方法 ELISA 法。三聚氰胺（英文名 Melamine，CAS:108-78-1 ，分子式 C3N6H6）是一种用途广泛的有机化工原料，禁止在食品和动物食品中添加，但因其结构中含有多个氨基氮而被一些不法商贩添加到植物蛋白中以提高蛋白的含量。其危害最早源于 2007 年 3 月美国发生的宠物猫、狗中毒死亡事件。经美国 F
2、DA 证实，猫、狗死亡是宠物食品的原料受三聚氰胺污染，并指出其中小麦蛋白原料来自中国，由此引起了国内外对三聚氰胺的高度关注。三聚氰胺一方面可能残留于食用动物组织，进而污染畜产品食品；另一方面，三聚氰胺也可以直接污染小麦、大米等谷物食品。无论何种污染途径，都可能危害人类健康、甚至造成人类中毒、死亡的危险。2008 年 9 月 16 日，国家质检总局公布了全国婴幼儿配方奶粉 22家生产企业的 69 批次产品检出了含量不同的三聚氰胺的检查结果，再次将三聚氰胺聚焦为食品安全检测中的重要检测对象。三聚氰胺在食品中的限量值，目前仅针对乳和乳制品。对于婴幼儿配方奶粉限量值我国和香港地区、澳大利亚、新西兰、加
3、拿大以及欧盟都制定在1mg/kg，美国没有对婴幼儿配方奶粉制定一个控制的限量；我国对其他乳和含乳 15%的食品限量值为 2.5mg/kg。三聚氰胺传统的检测方法有重量法、升华法，但方法检测限不能满足要求。近来发展起了色谱法。我国农业部发布饲料中三聚氰胺的测定公告，确定了饲料中三聚氰胺测定的农业行业标准NY/T1372-2007，该标准采用高效液相色谱法（HPLC ）和气相色谱-质谱联用法（GC/MS） ，HPLC 法最低定量限为 2mg/kg，GC/MS 法最低定量限为0.05mg/kg。2008 年 10 月 7 号，国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会批准发布了原料乳与乳制品中三
4、聚氰胺检测方法 （GB/T 22388-2008）国家标准，规定了高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/ 质谱法三种方法为三聚氰胺的检测方法，检测定量限分别为 2 mg/kg 、0.05 mg/kg 和 0.01 mg/kg。2008 年 10 月 15 日，又发布了原料乳中三聚氰2胺快速检测 液相色谱法 （GB/T22400-2008）国家标准，该标准的定量限为 0.3 mg/kg。然而，尽管色谱法已经很多，但不能完成现场大量样本的检测，而基于抗原抗体反应的免疫检测方法是一项大样本量现场快速的、准确的、成熟的筛查检测技术。本项目是参照美国 Abraxis LLC 公司建立的动
5、物源性食品中三聚氰胺快速检测方法-ELISA 法，制定相应的出入境检验检疫行业标准，作为 GB/T 22388-2008 和 GB/T22400-2008 方法的补充，为实验室和现场针对动物源性食品中三聚氰胺快速筛查提供检测依据，更为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。二、 编制依据1.本标准是按照 GB/T 1.1-2000标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写的规则 、/GN/T 20001.4-2001标准编写规则 第 4 部分：化学分析方法及 SN/T 0001-1995出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定 （简称基本规定 ）
6、的要求编写的。2.本标准是经大量实验研究、评估和验证后制定的。三、 方法概述基于竞争性 ELISA 的原理。先用甲醇-磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液将三聚氰胺从样品中萃取出来，再将所获得的样品萃取液与三聚氰胺辣根过氧化物酶（HRP ）耦合物和标准品一起加入包备有三聚氰胺抗体的多孔试剂板的微孔中发生反应，经过 30 分钟的培养，样品中的三聚氰胺和三聚氰胺 HRP 酶耦合物与三聚氰胺抗体竞争性结合。经过这 30 分钟的培养，任何没有结合的三聚氰胺和三聚氰胺 HRP 酶耦合物将被冲洗掉，显色酶底物加入微孔中，任何结合的酶耦合物都会使液体呈现蓝色。经过 10-20 分钟的培养，反应结束，用酶标仪读数。将
7、未知样品的读数和标准品的读数比较就能得出样品中的三聚氰胺浓度。四、 主要实验技术论证酶联免疫法之所以能够方便快捷地应用在食品分析中主要是由于其不需要经过繁琐的净化步骤，从而大大缩短了时间。实验比较了超纯水、PBS、PBST等几种常用的掩蔽剂对于消除基质影响的作用情况。结果显示采用 PBS 作为基质掩蔽剂可较好地消除基质影响。3五、 方法的主要技术指标1、方法检测限研究建立的三 聚 氰 胺 直接竞争 ELISA 检测方法，其标准溶液的线性范围为 20500 g/L。经加标回收试验，针对婴儿奶粉和婴儿豆奶粉的检测限1.0mg/kg，液态奶及含乳巧克力、乳清粉、酸奶等含乳食品样品经前处理及掩蔽剂稀释
8、后的检测限2.5mg/kg，均满足目前三聚氰胺的安全限量标准（MRLs）的要求，即 针 对 婴 幼 儿 为 1.0mg/kg 和 其 他 乳 品 和 含 乳 制 品 为2.5mg/kg。 同 时 本 方 法 还 使 用 于 肉 类 （ 鸡 、 鱼 肉 ） 、 鸡 蛋 和 酱 油 。 2、方法精密度严格按本标准所确定的操作程序，对三聚氰胺检测进行了精密度的测试，分别以板内变异和板间变异表示。取六个含不同三聚氰胺浓度的实验样品，进行 ELISA 分析，每个浓度实验样品作 10 个复孔，对测得抑制率（IC）进行分析，变异系数均10 %。取六个不同浓度的三聚氰胺标准溶液，进行 ELISA 分析，每个浓
9、度每天作两次分析，综合 5 天测得的抑制率（IC）吸光度值进行分析，变异系数均10 %。3、方法准确度选择 10 种不含三 聚 氰 胺 的样品，分别添加三 聚 氰 胺 至样品中 3 个不同含量水平，提取后采用直接竞争 ELISA 方法检测，计算样品加标回收率，以加标回收率表示检测方法的准确度。结果显示，回收率均在 81-128%之间（见表 1） 。表 1 不同样品中三 聚 氰 胺 的加标回收率（n6）样品 加标水平(mg/kg) 平均回收率（% ）1.8 1005 84鸡蛋10 882.4 1045 102冰激淋10 982.5 96巧克力5 94410 880.06 1170.25 120液
10、态奶0.5 1020.16 1060.25 112酸奶0.5 1051.25 812.5 92肉类（鸡肉）5 900.02 1200.05 112乳糖0.1 1220.8 1242.5 125婴儿豆奶粉5 1280.1 1100.25 96婴儿奶粉1 1164、 方法特异性抗三聚氰胺抗体与三嗪类似物的交叉反应可用最低检测剂量（LLD，约为90%B/Bo）或用抑制 50%的吸光值所需的剂量（50%B/Bo）表示。表 2 抗三聚氰胺抗体交叉反应化合物 LLD（ng/mL） 50%B/Bo (ng/mL)三聚氰胺 10 400三聚氰酸 400 10,000三嗪 10,000 10,000三嗪二铵 0
11、.1 2由表 2 可以看出所制备的抗三聚氰胺抗体与三嗪二铵有交叉反应，与三聚氰酸和三嗪的交叉反应性则很低。5、三 聚 氰 胺 检 测 的 液 相 色 谱 -串 联 质 谱 法 验 证 及 实 际 应 用5依据 GB/T 22388-2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法中的液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS ）验证本研究建立的 ELISA 方法，结果见表 3。结果表明，三聚氰胺直接竞争 ELISA 检测与仪器分析结果一致，但仪器方法回收率偏低。表 3 三聚氰胺直接竞争 ELISA 检测与仪器分析结果对照（n=3）ELISA UPLC-MS/MS样品加标水平(mg/kg) 回收率(%
12、) 回收率(%)冰激淋 2.4 104 79.3液态奶 0.06 117 89.4酸奶 0.16 106 74.7婴儿奶粉 0.1 110 79.4应用本标准方法对约 40 个实际样品进行了三 聚 氰 胺 的定量分析，并随机抽取了阴性检出结果样品（n=20） ，再以液相色谱-串联质谱法分析，均未检出三 聚 氰 胺 残留，表明阴性检出准确率为 100%，即假阴性为 0%；进一步对阴性样品（n=20 ）进行 三 聚 氰 胺 标准添加实验，添加水平为 0.1 mg/kg 2.4 mg/kg。以本标准所建立的 ELISA 方法与液相色谱-串联质谱法进行比对分析，添加样品的测定结果均为阳性，且回收率分布
13、在 70% 110% 之间。6、实验室间验证试验分别对液态奶和鸡肉样品添加三聚氰胺，针对液态奶添加水平分别为 0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0mg/kg，针对鸡肉样品添加水平分别为 1.8、5.0 mg/kg、 10.0 mg/kg。上述样品经北京化工大学分析测试中心、中国疾控中心、河北局、天津局、北京生命科学研究所等五个实验室的有关技术人员运用该测定方法进行验证，检测结果如表 4。6表 4 验证实验结果及实验室间精密度样品名称 液态奶 鸡肉添加水平mg/kg0.5 1.0 2.0 1.8 5.0 10.00.457 1.01 1.83 1.45 4.52 9.25北京化工大学分
14、析测试中心 0.412 0.92 1.79 1.57 4.38 8.150.447 0.89 1.78 1.69 4.81 7.97中国疾控中心0.434 0.93 1.88 1.59 4.27 8.130.401 0.87 1.66 1.47 4.11 8.28河北出入境检验检疫局 0.395 0.97 1.61 1.78 4.36 8.690.411 0.83 1.73 1.83 4.33 9.01天津出入境检验检疫局 0.398 0.89 1.85 1.51 4.09 8.730.388 1.05 1.88 1.88 4.02 8.11参加单位北京生命科学研究所 0.449 0.94 1
15、.83 1.62 4.16 8.51平均回收率(%) 0.42 0.93 1.78 1.64 4.31 8.48RSD (%) 5.7 6.6 5.3 9.0 5.1 5.8六、结论本标准简便易行，可快速、准确地对食品及农产品中的三 聚 氰 胺 残留进行筛选检验。方法的准确度、精确度、检测限均符合残留物检测的定量要求。7参考文献主要参考文献1、刘梅，李金强，田德金，等。固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测食品中的三聚氰胺。化学分析计量J，2008，17（2）：48-502、江泉观，纪云晶，常元勋。环境化学毒物防治手册M。北京：化学工业出版社，2004：727-7283、NY/T1372-2007 饲料中三聚氰胺的测定4、GB/T22400-2008 原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法5、GB/T22400-2008 原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法
